【摘要】：目的:紅系核心轉(zhuǎn)錄因子GATA-1,調(diào)控眾多下游蛋白因子和microRNAs,推進(jìn)正常紅系分化進(jìn)程。miR-451a作為紅系特異性miRNA,受GATA-1調(diào)控參與紅系分化過程;miR-210-3p受低氧調(diào)控明顯,且與紅系分化相關(guān)。本文將初步探討低氧下GATA-1的表達(dá)變化情況以及GATA-1是如何通過調(diào)控miR-451a及miR-210-3p參與紅系分化過程。方法:(1)結(jié)合聯(lián)苯胺染色陽性細(xì)胞率、γ-globin的mRNA表達(dá)變化判斷不同氧濃度下的細(xì)胞分化效率;(2)MTS細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖的情況與流式細(xì)胞周期檢測結(jié)果分析細(xì)胞增殖水平的變化;(3)Western blot檢測GATA-1表達(dá)變化情況;(4)qRT-PCR檢測miR-451a及miR-210-3p的表達(dá)變化情況;(5)結(jié)合聯(lián)苯胺染色陽性細(xì)胞率、γ-globin的mRNA水平的變化判斷過表達(dá)GATA-1后紅系分化情況;(6)采用qRT-PCR檢測過表達(dá)GATA-1后miR-451a及miR-210-3p的表達(dá)變化情況;(7)結(jié)合聯(lián)苯胺染色陽性細(xì)胞率、γ-globin的mRNA水平的變化分別檢測過表達(dá)miR-451a、過表達(dá)和抑制miR-210-3p后的紅系分化情況;(8)采用Western blot檢測過表達(dá)miR-451a后14-3-3ζ蛋白的表達(dá)水平、過表達(dá)及抑制miR-210-3p后Smad2蛋白的表達(dá)水平;(9)結(jié)合聯(lián)苯胺染色陽性細(xì)胞率、γ-globin的mRNA水平的變化判斷Smad2抑制后紅系分化情況。結(jié)果:(1)聯(lián)苯胺染色結(jié)果顯示,1%O_2條件下72、96 h陽性細(xì)胞率明顯高于常氧(P0.05);而3%O_2條件下常氧、低氧各時(shí)間點(diǎn)間無明顯差異;γ-globin的檢測結(jié)果顯示,1%O_2條件下低氧96 h的表達(dá)水平高于常氧組(P0.05),而3%O_2條件下與常氧組無明顯差異。(2)結(jié)合MTS及細(xì)胞周期檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同氧濃度下細(xì)胞的增殖水平與常氧組無明顯差異(P0.05)。(3)Western blot檢測結(jié)果顯示,K562細(xì)胞經(jīng)hemin誘導(dǎo)至72 h,低氧組GATA-1蛋白的表達(dá)水平顯著高于常氧組(P0.05)。(4)qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,hemin誘導(dǎo)K562細(xì)胞至96 h,miR-451a及miR-210-3p均表現(xiàn)出明顯的低氧高于常氧的變化趨勢(P0.05)。(5)當(dāng)GATA-1過表達(dá)后,聯(lián)苯胺染色陽性細(xì)胞率及γ-globin的表達(dá)水平均顯著高于NC組(P0.05)。(6)過表達(dá)GATA-1后,miR-451a及miR-210-3p表達(dá)均高于NC組(P0.05)。(7)過表達(dá)miR-451a及miR-210-3p后,聯(lián)苯胺染色陽性細(xì)胞率及γ-globin的表達(dá)水平顯著高于NC組(P0.05);抑制miR-210-3p后聯(lián)苯胺染色陽性細(xì)胞率及γ-globin的表達(dá)水平在常氧條件下顯著低于NC組(P0.05),低氧條件下則與NC組無明顯差異。(8)Western blot檢測14-3-3ζ蛋白表達(dá)結(jié)果顯示,當(dāng)miR-451a過表達(dá)后,其蛋白水平出現(xiàn)明顯降低(P0.05),且低氧條件下降低更為明顯;Western blot檢測Smad2蛋白表達(dá)結(jié)果顯示,當(dāng)miR-210-3p過表達(dá)后,其蛋白水平與NC組對比出現(xiàn)明顯降低(P0.05);當(dāng)miR-210-3p抑制后,其蛋白水平與NC組對比出現(xiàn)明顯上升(P0.05)。(9)抑制Smad2在K562細(xì)胞中的表達(dá)后,聯(lián)苯胺染色陽性細(xì)胞率及γ-globin的表達(dá)水平較NC組均出現(xiàn)明顯升高(P0.05)。結(jié)論:(1)低氧下GATA-1表達(dá)水平顯著升高,可上調(diào)miR-451a的表達(dá),抑制下游靶基因14-3-3ζ,發(fā)揮促紅系分化的作用。(2)GATA-1可與miR-210-3p的啟動(dòng)子區(qū)域直接結(jié)合。(3)低氧下GATA-1上調(diào)miR-210-3p的表達(dá)水平,進(jìn)而可能通過下調(diào)Smad2的表達(dá)促進(jìn)紅系分化。
【學(xué)位授予單位】：青海大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R329.2
【圖文】：

青海大學(xué)碩士學(xué)位 第 3 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果第 3 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 氧濃度的篩選3.1.1 不同氧濃度對分化的影響3.1.1.1 聯(lián)苯胺染色檢測陽性細(xì)胞率如圖 1、2 和表 1、2 所示，不同氧濃度下聯(lián)苯胺染色陽性細(xì)胞率表明，組不同時(shí)間點(diǎn)間，陽性細(xì)胞率均呈上升趨勢（P＜0.05）；1%O2濃度下各時(shí)間點(diǎn)性細(xì)胞率顯著高于常氧組（P＜0.05），而 3%O2濃度下則與常氧組無明顯差異＞0.05）。

圖 2 3%O2聯(lián)苯胺染色結(jié)果（100×）Figure 2 3%O2benzidine staining results (100×)表 2 經(jīng) hemin 誘導(dǎo)后常氧組和 3%低氧組聯(lián)苯胺染色細(xì)胞陽性率（ x±SD）Table 2 Cell positive rates of benzidine staining in the normoxia group and the 3% hypoxic group after hemininduction（ x±SD）組別 n 24h(%) 48h(%) 72h(%) 96h(%) F P常氧組 3 3.70±0.42 37.43±0.53#50.91±1.85#57.85±0.45#1701.386 0.0003%低氧組 3 4.04±0.05 40.89±4.05#54.85±0.95#59.76±1.96#360.269 0.000t -1.392 -1.330 -3.281 -1.645P 0.236 0.254 0.03 0.175注：#P＜0.05 vs 24 h，*P＜0.05 vs 常氧組

圖 3 不同氧濃度下 γ-globin 的 qRT-PCR 檢測結(jié)果（ x±SD，#：P＜0.05 vs 組內(nèi)，*：P＜0.05 vs 組間，左為 1%O2，右為 3%O2）Figure 3 The detection of γ-globin by qRT-PCR at different oxygen condition（ x±SD，#：P＜0.05 vs intra-group，*：P＜0.05 vs inter-group,left is 1%O2,right is 3%O2）.2 不同氧濃度對增殖的影響.2.1 MTS 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖水平變化為探討不同氧濃度對細(xì)胞增殖的影響，篩選合適造模條件，采用 MTS 細(xì)殖實(shí)驗(yàn)檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 4 所示，不同氧濃度下細(xì)胞增殖率與常氧組無明異（P＞0.05）。

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7 周q

本文編號：2743522