【摘要】：THAP11是THAP蛋白(Thanatos-associated protein)家族中的最新成員,人THAP11在小鼠中的同源基因稱作Ronin。Ronin最早發(fā)現(xiàn)于小鼠胚胎發(fā)育早期階段,其對于體內(nèi)和體外維持胚胎干細(xì)胞多能性都是必須的�，F(xiàn)有研究顯示,THAP11主要通過轉(zhuǎn)錄因子相互作用網(wǎng)絡(luò)調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及線粒體功能,主要體現(xiàn)在抑制腫瘤細(xì)胞的生長、調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞的干性和調(diào)控多能干細(xì)胞的增殖與分化的過程中。但THAP11對造血干細(xì)胞的調(diào)控作用仍未見報(bào)道。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),在紅白血病細(xì)胞系(K562)中,THAP11調(diào)控紅系/巨核系分化平衡,這提示我們THAP11可能在造血調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用。本研究利用人原代臍帶血CD34~+細(xì)胞以及條件性敲除小鼠模型,系統(tǒng)分析了THAP11對HSC功能以及造血系統(tǒng)發(fā)育的影響。基于RNAi慢病毒系統(tǒng),敲低人臍帶血(Cord blood,CB)CD34~+細(xì)胞中THAP11基因表達(dá),檢測THAP11對HSC體內(nèi)重建、體外生長、增殖、周期以及凋亡的影響。結(jié)果顯示,將敲低THAP11的CB CD34~+細(xì)胞移植入經(jīng)致死劑量照射的免疫缺陷小鼠中,移植后三個(gè)月,THAP11干涉組人源GFP~+細(xì)胞重建率明顯低于對照組。體外集落培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,敲低THAP11后,CB CD34~+細(xì)胞成集落能力顯著降低,且與干涉效率相關(guān)。而體外擴(kuò)增培養(yǎng)體系中,THAP11干涉后,CB CD34~+細(xì)胞在體外培養(yǎng)的過程中增殖速率降低,CB CD34~+細(xì)胞周期進(jìn)展阻滯在G0/G1期,撤除所有細(xì)胞因子,THAP11干涉組細(xì)胞凋亡增多。在巨核系誘導(dǎo)培養(yǎng)體系中,敲低THAP11后CB CD34~+細(xì)胞向巨核系分化減少;在紅系誘導(dǎo)培養(yǎng)體系中,敲低THAP11后CD34~+細(xì)胞向紅系分化也減少。以上研究結(jié)果表明,THAP11對人造血干細(xì)胞功能有重要的調(diào)控作用,但調(diào)控作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。本研究在實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)上,基于LoxP-Cre系統(tǒng)構(gòu)建了Ronin基因造血系統(tǒng)條件性敲除(Conditional Knockout,CKO)小鼠,統(tǒng)計(jì)Ronin~(flox/flo x)(flanked by loxP)基因型小鼠與Ronin~(flo x/+)Vav-iCre~+基因型小鼠交配后產(chǎn)生子代基因型比例,結(jié)果顯示Ronin~(flox/flo x)Vav-iCre~+基因型的小鼠實(shí)際出生率不符合孟德爾定律,僅有1只小鼠出生且在一周內(nèi)死亡,表明造血系統(tǒng)特異敲除Ronin導(dǎo)致胚胎無法存活。進(jìn)一步解剖13.5dpc(days post coitum)、14.5dpc、15.5dpc和18.5dpc孕鼠胚胎,觀察Ronin CKO小鼠形態(tài)學(xué)表型,結(jié)果顯示Ronin CKO小鼠胚胎通體蒼白,卵黃囊、胎盤、胎肝三個(gè)主要造血器官明顯發(fā)白,且隨著時(shí)間的推移,形態(tài)學(xué)表型加重,胎肝變小且細(xì)胞數(shù)量減少,循環(huán)血中紅細(xì)胞脫核比降低,胚胎表現(xiàn)出嚴(yán)重貧血表型。進(jìn)一步分析13.5dpc、14.5dpc和15.5dpc孕鼠胚胎胎肝中細(xì)胞組成,利用CD71和TER119標(biāo)記不同發(fā)育階段紅細(xì)胞,結(jié)果顯示,紅系發(fā)育在CD71~(hi)Ter119~+細(xì)胞階段受到阻滯,阻滯發(fā)生在細(xì)胞由大到小的進(jìn)展過程中,且整個(gè)胎肝中Ter119~+細(xì)胞嚴(yán)重減少。利用Lin~-c-Kit~+Sca1~-標(biāo)記造血祖細(xì)胞(Hematopoietic progenitor cell,HPC)、Lin~-c-Kit~+Sca1~+標(biāo)記造血干細(xì)胞(Haematopoietic stem cell,HSC),分析胎肝中造血干、祖細(xì)胞組成。結(jié)果顯示,13.5天時(shí)Ronin CKO小鼠胎肝中Lin~-c~-Kit~+Sca1~+細(xì)胞數(shù)量顯著增多,隨著胚胎的發(fā)育至15.5天時(shí)細(xì)胞數(shù)量無明顯差異;13.5天時(shí),Lin~-c~-Kit~+Sca1~-細(xì)胞數(shù)量無明顯差異,至15.5天時(shí),Lin~-c~-Kit~+Sca1~-細(xì)胞數(shù)量顯著減少。體外集落形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,Ronin缺失后13.5dpc胎肝細(xì)胞集落成能力顯著低降。此外,13.5dpc、14.5dpc和15.5dpc Ronin CKO小鼠胎肝中細(xì)胞凋亡均顯著增加。Ronin CKO小鼠模型的建立證實(shí)Ronin是造血系統(tǒng)發(fā)育過程中必須的調(diào)節(jié)因子,條件性敲除導(dǎo)致小鼠胚胎嚴(yán)重缺血,無法正常存活。胚胎表型的初步檢測結(jié)果提示,Ronin在造血早期發(fā)育過程中的調(diào)控作用于兩個(gè)節(jié)點(diǎn):一方面,在胚胎紅系發(fā)育過程中,Ronin條件性缺失阻滯紅系終末分化,難以產(chǎn)生成熟紅細(xì)胞,導(dǎo)致胚胎嚴(yán)重貧血;另一方面,Ronin條件性缺失影響了造血干、祖細(xì)胞功能,最終導(dǎo)致胚胎整個(gè)造血系統(tǒng)發(fā)育障礙。綜上所述,本研究在敲低THAP11表達(dá)的人CB CD34~+原代細(xì)胞模型和Ronin CKO小鼠模型中研究了THAP11對造血干細(xì)胞功能以及造血系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控作用,證實(shí)THAP11是調(diào)控造血干細(xì)胞功能及造血系統(tǒng)發(fā)育過程中必需的調(diào)控因子,并為后續(xù)機(jī)制研究提供了可靠線索和動(dòng)物模型。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q344
【圖文】：

α購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司；慢病毒包裝質(zhì)粒 pMD2G、pSPAX2，表達(dá)質(zhì)粒 pSicoR、siTHAP11-pScicoR 為本實(shí)驗(yàn)室保存。2.1.4. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物B-NSGTM(B-NDG ) （NOD-Prkdcscidll2rgtm1/Bcgen）小鼠購買自北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司，于軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院 20 號院動(dòng)物飼養(yǎng)中心，SPF 級條件下飼養(yǎng)，環(huán)境溫度保持在 20-26℃，日溫差不差過 4℃，濕度為 40%-70%，光照周期 12 小時(shí)：12 小時(shí)，光照強(qiáng)度 15-20lux（鼠籠中照度），噪聲不超過 60 分貝。Roninflo x/-小鼠由華夏凱奇公司制備構(gòu)建策略如圖 1A 所示，Vav-iCre+小鼠由軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院從玉文教授贈(zèng)送(Jackson Laboratory；#008610；B6.Cg-Commd10Tg(Vav1-icre)A2Kio/J)，兩種小鼠均為 C57BL/6J 背景，飼養(yǎng)于軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院27 號院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 SPF 級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房飼養(yǎng)、繁殖（繁殖策略見 2.2.3）。

圖2 Roninflox/floxVav-iCre+小鼠繁殖策略Fig 2 Roninflox/floxVav-iCre+mouse breeding strategy2.2.5. 小鼠基因型鑒定1)小鼠基因型鑒定DNA模板制備取3周齡小鼠尾尖5mm置于1.5mL 離心管中，每管加入300μL組織消化液（50mM Tris-HCl (pH=7.5)，100mM NaCl，10mM EDTA，0.5%SDS）和12μL蛋白酶K（10mg/mL，Merck公司），顛倒混勻，置于60℃震蕩裂解過夜。之后加入150μL飽和氯化鈉溶液，渦旋震蕩，冰浴10min，12000rpm離心7min。小心吸取上清350μL到新離心管，加入650μL無水乙醇，渦旋混勻，可以看到有白色絮狀沉淀，13000rpm離心5min。棄掉上清，加入75%乙醇750μL，上下顛倒5～10次，13000rpm離心5min，棄上清，靜置使乙醇揮發(fā)干凈。加入100μL去離子水，將DNA溶解2小時(shí)以上，4℃保存?zhèn)溆谩?

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 ;美制造出具有造血干細(xì)胞功能的細(xì)胞[J];廣州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2017年04期

2 鄧雅文;朱剛;賈書花;;人造血干細(xì)胞的臨床應(yīng)用研究[J];長治醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2018年01期

3 肖恩.J.墨里森;;造血干細(xì)胞技術(shù)或可抑制腫瘤活動(dòng)[J];中國科技產(chǎn)業(yè);2018年08期

4 胡珊;;寧波造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)15年 76例無關(guān)血緣的生命接力 傳遞城市溫度[J];寧波通訊;2018年14期

5 ;Nature:重大突破,揭示維生素C調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞功能阻止白血病產(chǎn)生機(jī)制[J];中學(xué)生物教學(xué);2017年16期

6 張靜靜;呂紅霞;楊巖;周棟;黃丹;劉虹辰;王嬌;王睿;閆金松;;外周造血干細(xì)胞采集與凍存質(zhì)量分析[J];中國醫(yī)學(xué)前沿雜志(電子版);2017年01期

7 ;人類首次在實(shí)驗(yàn)室中誘導(dǎo)出功能性造血干細(xì)胞[J];上海醫(yī)藥;2017年11期

8 ;實(shí)驗(yàn)室首次培育出人體造血干細(xì)胞[J];科技傳播;2017年10期

9 ;違背常理!造血干細(xì)胞既“殺敵”也“自損”[J];微創(chuàng)醫(yī)學(xué);2017年04期

10 ;美造出有造血干細(xì)胞功能的細(xì)胞[J];健康博覽;2017年07期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 唐佩弦;;從造血干細(xì)胞研究歷史看過去與未來[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第八次全國血液學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

2 宋學(xué)輝;羅志紅;栗玉萍;代敏;;5471份無償捐獻(xiàn)造血干細(xì)胞血液標(biāo)本相關(guān)數(shù)據(jù)分析[A];中國輸血協(xié)會(huì)第四屆輸血大會(huì)論文集[C];2006年

3 李罡燦;宋艷萍;胡凱;杜明珠;王浩;王琦俠;;不同凍存條件對造血干細(xì)胞保存效果的臨床研究[A];第10屆全國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要匯編[C];2005年

4 孟愛民;李德冠;張恒;;造血干細(xì)胞衰老與臨床轉(zhuǎn)化研究[A];轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研討會(huì)論文集[C];2010年

5 程濤;;造血干細(xì)胞基礎(chǔ)研究若干重要方向[A];中國生理學(xué)會(huì)第24屆全國會(huì)員代表大會(huì)暨生理學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2014年

6 ;滿載愛心 踐行企業(yè)社會(huì)責(zé)任 太平洋人壽舉辦捐獻(xiàn)造血干細(xì)胞現(xiàn)場采血活動(dòng)[A];黑龍江保險(xiǎn)2014年第3期（總第170期）[C];2014年

7 王瑩;王云貴;金潔;錢其軍;錢文斌;;嵌合型溶瘤腺病毒對造血干細(xì)胞體外凈化作用的研究[A];2009年浙江省中醫(yī)藥學(xué)會(huì)血液病學(xué)術(shù)年會(huì)、浙江省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)血液病學(xué)術(shù)年會(huì)暨國家級中西醫(yī)結(jié)合血液病新進(jìn)展繼續(xù)教育學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2009年

8 劉宗印;肖東杰;;造血干細(xì)胞4℃短期儲(chǔ)存后細(xì)胞活性的研究[A];第十屆全國風(fēng)濕病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2005年

9 王立生;孫惠燕;;MicroRNA-486-5p調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞紅系分化及機(jī)制研究[A];第13屆全國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要[C];2011年

10 何吉;秦斐;朱發(fā)明;劉晉輝;陳舒;戴兵;項(xiàng)盈;嚴(yán)力行;;重組人脫氧核糖核酸酶預(yù)防凍存復(fù)蘇后臍血造血干細(xì)胞凝集[A];中國輸血協(xié)會(huì)第四屆輸血大會(huì)論文集[C];2006年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 通訊員 楊琴珍;我州又有2名志愿者成功捐獻(xiàn)造血干細(xì)胞[N];大理日報(bào)(漢);2019年

2 首席記者 肖干;我市正式成立造血干細(xì)胞工作站[N];淮北日報(bào);2019年

3 本報(bào)記者 張佳星;世界首例基因編輯人體造血干細(xì)胞成功移植[N];科技日報(bào);2019年

4 通訊員 夏聲朝;湖南捐獻(xiàn)造血干細(xì)胞連續(xù)3年增長率全國第一[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2019年

5 本報(bào)記者 晁瑾 實(shí)習(xí)生 張曉晗;造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)：點(diǎn)燃生命的“火種”[N];新疆日報(bào)(漢);2019年

6 黃辛 林濱霞;研究發(fā)現(xiàn)造血干細(xì)胞進(jìn)入青春期會(huì)“緊急制動(dòng)”[N];中國科學(xué)報(bào);2018年

7 本報(bào)記者 王磊;話劇《髓·愿》，為申城造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)志愿者點(diǎn)贊[N];文匯報(bào);2019年

8 本報(bào)記者 沈則瑾;開啟造血干細(xì)胞研究新時(shí)代[N];經(jīng)濟(jì)日報(bào);2019年

9 通訊員 周琪 首席記者 唐聞佳;上海今年涉外首例造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)完成[N];文匯報(bào);2019年

10 魯紅;山東實(shí)現(xiàn)2例涉外造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)[N];中國紅十字報(bào);2019年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 蔡鵬程;核糖體蛋白Urb2通過P53信號途徑調(diào)控斑馬魚造血干細(xì)胞的發(fā)育[D];西南大學(xué);2018年

2 張宇;造血干細(xì)胞（CD34~+細(xì)胞）體外高效擴(kuò)增及向紅細(xì)胞分化制備通用血液的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2018年

3 王佳;造血干細(xì)胞APC/C功能研究及其對再生障礙性貧血的意義[D];上海交通大學(xué);2015年

4 張琳琳;造血干細(xì)胞發(fā)育中長鏈非編碼RNA的功能研究[D];軍事科學(xué)院;2019年

5 王童潔;轉(zhuǎn)錄因子Nupr1和Trim27在造血干細(xì)胞中的功能研究[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2018年

6 楊定華;vIL-10基因修飾造血干細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠心臟移植免疫耐受的實(shí)驗(yàn)研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2003年

7 閆鳳英;造血調(diào)控因子HAPO、PF4對造血干細(xì)胞調(diào)節(jié)的體內(nèi)外研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2005年

8 薛興奎;趨化分子LTD4、S1P和SDF-1對造血干細(xì)胞作用及其機(jī)制的研究[D];浙江大學(xué);2007年

9 張華玲;造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)染多藥耐藥基因和體外擴(kuò)增支持大劑量化療的研究[D];山東大學(xué);2007年

10 李斯丹;骨重塑在造血干細(xì)胞動(dòng)員中的機(jī)制及應(yīng)用研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張麗;ARF6調(diào)控小鼠造血干細(xì)胞及MLL-AF9誘導(dǎo)的急性白血病細(xì)胞生物學(xué)功能的研究[D];吉林大學(xué);2019年

2 孫文沫;TLR5激動(dòng)劑CBLB502對PTN誘導(dǎo)造血干細(xì)胞增殖作用影響的研究[D];沈陽醫(yī)學(xué)院;2019年

3 周循;貯存式自體成分輸血對骨髓造血功能及造血干細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2019年

4 李秀;THAP11對造血干細(xì)胞功能與發(fā)育的調(diào)控作用研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2019年

5 倪艷麗;單細(xì)胞技術(shù)在造血系統(tǒng)研究中的應(yīng)用[D];軍事科學(xué)院;2019年

6 黃海軍;胎盤造血干細(xì)胞庫構(gòu)建的初步研究[D];華南理工大學(xué);2018年

7 葛俊男;臍帶血造血干細(xì)胞的分離與貯藏工藝過程研究[D];河北科技大學(xué);2019年

8 徐正陽;運(yùn)用轉(zhuǎn)基因模型探討骨形態(tài)發(fā)生蛋白4對骨髓造血干細(xì)胞的調(diào)控功能[D];蚌埠醫(yī)學(xué)院;2018年

9 Givaapil Ariunjargal（阿榮吉日嘎拉）;多解剖部位不同造血發(fā)育階段小鼠造血干細(xì)胞的分離及其生物學(xué)特性[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2018年

10 韓米麗;圍產(chǎn)期造血干細(xì)胞業(yè)務(wù)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)[D];天津大學(xué);2017年

本文編號：2741366