【摘要】：THAP11是THAP蛋白(Thanatos-associated protein)家族中的最新成員,人THAP11在小鼠中的同源基因稱作Ronin。Ronin最早發(fā)現(xiàn)于小鼠胚胎發(fā)育早期階段,其對于體內和體外維持胚胎干細胞多能性都是必須的�，F(xiàn)有研究顯示,THAP11主要通過轉錄因子相互作用網絡調控細胞的增殖、分化、凋亡及線粒體功能,主要體現(xiàn)在抑制腫瘤細胞的生長、調節(jié)胚胎干細胞的干性和調控多能干細胞的增殖與分化的過程中。但THAP11對造血干細胞的調控作用仍未見報道。我們實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),在紅白血病細胞系(K562)中,THAP11調控紅系/巨核系分化平衡,這提示我們THAP11可能在造血調控過程中發(fā)揮著重要作用。本研究利用人原代臍帶血CD34~+細胞以及條件性敲除小鼠模型,系統(tǒng)分析了THAP11對HSC功能以及造血系統(tǒng)發(fā)育的影響�；赗NAi慢病毒系統(tǒng),敲低人臍帶血(Cord blood,CB)CD34~+細胞中THAP11基因表達,檢測THAP11對HSC體內重建、體外生長、增殖、周期以及凋亡的影響。結果顯示,將敲低THAP11的CB CD34~+細胞移植入經致死劑量照射的免疫缺陷小鼠中,移植后三個月,THAP11干涉組人源GFP~+細胞重建率明顯低于對照組。體外集落培養(yǎng)實驗結果顯示,敲低THAP11后,CB CD34~+細胞成集落能力顯著降低,且與干涉效率相關。而體外擴增培養(yǎng)體系中,THAP11干涉后,CB CD34~+細胞在體外培養(yǎng)的過程中增殖速率降低,CB CD34~+細胞周期進展阻滯在G0/G1期,撤除所有細胞因子,THAP11干涉組細胞凋亡增多。在巨核系誘導培養(yǎng)體系中,敲低THAP11后CB CD34~+細胞向巨核系分化減少;在紅系誘導培養(yǎng)體系中,敲低THAP11后CD34~+細胞向紅系分化也減少。以上研究結果表明,THAP11對人造血干細胞功能有重要的調控作用,但調控作用機制還需進一步研究。本研究在實驗室前期研究基礎上,基于LoxP-Cre系統(tǒng)構建了Ronin基因造血系統(tǒng)條件性敲除(Conditional Knockout,CKO)小鼠,統(tǒng)計Ronin~(flox/flo x)(flanked by loxP)基因型小鼠與Ronin~(flo x/+)Vav-iCre~+基因型小鼠交配后產生子代基因型比例,結果顯示Ronin~(flox/flo x)Vav-iCre~+基因型的小鼠實際出生率不符合孟德爾定律,僅有1只小鼠出生且在一周內死亡,表明造血系統(tǒng)特異敲除Ronin導致胚胎無法存活。進一步解剖13.5dpc(days post coitum)、14.5dpc、15.5dpc和18.5dpc孕鼠胚胎,觀察Ronin CKO小鼠形態(tài)學表型,結果顯示Ronin CKO小鼠胚胎通體蒼白,卵黃囊、胎盤、胎肝三個主要造血器官明顯發(fā)白,且隨著時間的推移,形態(tài)學表型加重,胎肝變小且細胞數(shù)量減少,循環(huán)血中紅細胞脫核比降低,胚胎表現(xiàn)出嚴重貧血表型。進一步分析13.5dpc、14.5dpc和15.5dpc孕鼠胚胎胎肝中細胞組成,利用CD71和TER119標記不同發(fā)育階段紅細胞,結果顯示,紅系發(fā)育在CD71~(hi)Ter119~+細胞階段受到阻滯,阻滯發(fā)生在細胞由大到小的進展過程中,且整個胎肝中Ter119~+細胞嚴重減少。利用Lin~-c-Kit~+Sca1~-標記造血祖細胞(Hematopoietic progenitor cell,HPC)、Lin~-c-Kit~+Sca1~+標記造血干細胞(Haematopoietic stem cell,HSC),分析胎肝中造血干、祖細胞組成。結果顯示,13.5天時Ronin CKO小鼠胎肝中Lin~-c~-Kit~+Sca1~+細胞數(shù)量顯著增多,隨著胚胎的發(fā)育至15.5天時細胞數(shù)量無明顯差異;13.5天時,Lin~-c~-Kit~+Sca1~-細胞數(shù)量無明顯差異,至15.5天時,Lin~-c~-Kit~+Sca1~-細胞數(shù)量顯著減少。體外集落形成實驗的結果顯示,Ronin缺失后13.5dpc胎肝細胞集落成能力顯著低降。此外,13.5dpc、14.5dpc和15.5dpc Ronin CKO小鼠胎肝中細胞凋亡均顯著增加。Ronin CKO小鼠模型的建立證實Ronin是造血系統(tǒng)發(fā)育過程中必須的調節(jié)因子,條件性敲除導致小鼠胚胎嚴重缺血,無法正常存活。胚胎表型的初步檢測結果提示,Ronin在造血早期發(fā)育過程中的調控作用于兩個節(jié)點:一方面,在胚胎紅系發(fā)育過程中,Ronin條件性缺失阻滯紅系終末分化,難以產生成熟紅細胞,導致胚胎嚴重貧血;另一方面,Ronin條件性缺失影響了造血干、祖細胞功能,最終導致胚胎整個造血系統(tǒng)發(fā)育障礙。綜上所述,本研究在敲低THAP11表達的人CB CD34~+原代細胞模型和Ronin CKO小鼠模型中研究了THAP11對造血干細胞功能以及造血系統(tǒng)發(fā)育的調控作用,證實THAP11是調控造血干細胞功能及造血系統(tǒng)發(fā)育過程中必需的調控因子,并為后續(xù)機制研究提供了可靠線索和動物模型。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q344
【圖文】：

α購自北京博邁德生物技術有限公司；慢病毒包裝質粒 pMD2G、pSPAX2，表達質粒 pSicoR、siTHAP11-pScicoR 為本實驗室保存。2.1.4. 實驗動物B-NSGTM(B-NDG ) （NOD-Prkdcscidll2rgtm1/Bcgen）小鼠購買自北京百奧賽圖基因生物技術有限公司，于軍事科學院軍事醫(yī)學研究院 20 號院動物飼養(yǎng)中心，SPF 級條件下飼養(yǎng)，環(huán)境溫度保持在 20-26℃，日溫差不差過 4℃，濕度為 40%-70%，光照周期 12 小時：12 小時，光照強度 15-20lux（鼠籠中照度），噪聲不超過 60 分貝。Roninflo x/-小鼠由華夏凱奇公司制備構建策略如圖 1A 所示，Vav-iCre+小鼠由軍事科學院軍事醫(yī)學研究院從玉文教授贈送(Jackson Laboratory；#008610；B6.Cg-Commd10Tg(Vav1-icre)A2Kio/J)，兩種小鼠均為 C57BL/6J 背景，飼養(yǎng)于軍事科學院軍事醫(yī)學研究院27 號院實驗動物中心 SPF 級實驗動物房飼養(yǎng)、繁殖（繁殖策略見 2.2.3）。

圖2 Roninflox/floxVav-iCre+小鼠繁殖策略Fig 2 Roninflox/floxVav-iCre+mouse breeding strategy2.2.5. 小鼠基因型鑒定1)小鼠基因型鑒定DNA模板制備取3周齡小鼠尾尖5mm置于1.5mL 離心管中，每管加入300μL組織消化液（50mM Tris-HCl (pH=7.5)，100mM NaCl，10mM EDTA，0.5%SDS）和12μL蛋白酶K（10mg/mL，Merck公司），顛倒混勻，置于60℃震蕩裂解過夜。之后加入150μL飽和氯化鈉溶液，渦旋震蕩，冰浴10min，12000rpm離心7min。小心吸取上清350μL到新離心管，加入650μL無水乙醇，渦旋混勻，可以看到有白色絮狀沉淀，13000rpm離心5min。棄掉上清，加入75%乙醇750μL，上下顛倒5～10次，13000rpm離心5min，棄上清，靜置使乙醇揮發(fā)干凈。加入100μL去離子水，將DNA溶解2小時以上，4℃保存?zhèn)溆谩?

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