【摘要】：嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)是一類重要的食品安全級菌株,常用于酸奶或奶酪等乳制品的生產。嗜熱鏈球菌利用胞內的β-半乳糖苷酶將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖,前者通過糖酵解途徑轉化成乳酸,而后者不能被消耗并全部泵到細胞外,導致乳制品中殘留了大量的半乳糖和部分未被利用的乳糖,不利于人類健康。除此之外,β-半乳糖苷酶還能夠發(fā)揮轉糖基活性生成低聚半乳糖(GOS),減少發(fā)酵乳中半乳糖的殘留。因此,調節(jié)其分解活性與轉糖基活性有助于生產低糖健康的乳制品,然而對其轉糖基活性的相關位點少有報道,限制了其在食品工業(yè)的應用。近年來,由于細胞固定化酶有更好的催化活性和穩(wěn)定性,乳酸菌表面展示系統(tǒng)得到迅速發(fā)展,而關于嗜熱鏈球菌表面展示系統(tǒng)的報道較少。本文主要利用生物信息學分析對S.thermophilusSDMCC050237的β-半乳糖苷酶進行理性改造,從而提高其轉糖基活性,同時鑒定并研究了嗜熱鏈球菌的烯醇化酶的表面錨定功能及用于表面展示的潛力。具體的實驗結果如下:1.嗜熱鏈球菌中高活性p-半乳糖苷酶的篩選β-半乳糖苷酶對嗜熱鏈球菌的食品工業(yè)應用有重要意義。本文使用X-Gal平板檢測了嗜熱鏈球菌產β-半乳糖苷酶的能力并以oNPG為底物檢測了酶活,發(fā)現(xiàn)不同菌株的β-半乳糖苷酶之間存在活性差異。將活性較高的細胞破碎液與乳糖溶液混合反應后利用TLC法初步分析了反應液中糖的成分,結果表明,不同菌株的β-半乳糖苷酶在自然條件下轉糖基活性較弱且無明顯差距,導致其發(fā)酵液中殘留了較多的半乳糖。2.β 半乳糖苷酶BgaQ的酶學性質研究及其轉糖基活性條件的優(yōu)化以 S.thermophilus SDMCC050237為材料,克隆其β-半乳糖苷酶基因bgaQ,使用表達質粒pET28a(+)在E.coli DE3中過表達BgaQ蛋白。鎳柱親和層析純化后獲得目標蛋白(113 kDa)。以oNPG和乳糖為底物時BgaQ的酶活分別為4725.3±155.4 U/mg和88.3±1.4U/mg。酶學性質表明,BgaQ的最適溫度為50℃,溫度耐受范圍為37℃～60℃,高溫下穩(wěn)定性下降;最適pH為8.5,pH值穩(wěn)定性較高。另外,Na-、K-、Mg2-、Ba2+和Co2+促進酶活,而Fe2+、Ni2-和Co2+抑制酶活,該酶對Zn2-和Cu2-不耐受。轉糖基活性的條件優(yōu)化結果表明,該酶生成GOS的最優(yōu)乳糖濃度為25%,最優(yōu)溫度為50℃,最優(yōu)pH為6.5。優(yōu)化后的反應條件為15%的乳糖濃度,pH=6.5,50℃條件下反應5 h,GOS的轉化率為45.0±3.4%。3.定點突變提高β-半乳糖苷酶的轉糖基活性嗜熱鏈球菌的β-半乳糖苷酶具有分解活性和轉糖基活性,其工業(yè)應用具有重要意義和廣闊前景。為了提高嗜熱鏈球菌β-半乳糖苷酶的轉糖基活性,本文對篩選出的β-半乳糖苷酶BgaQ進行同源建模,通過序列疊合找到了兩個谷氨酸活性位點,以β-3'-galactosyl-lactose為底物進行Autodocking分析,獲得轉糖基活性相關位點并通過序列比對分析成功構建了Y801H/P802G突變體蛋白mBgaQ。以oNPG和乳糖為底物測得mBgaQ的酶活力分別為5957.7±209.1 U/mg和81.9±3.6 U/mg,以乳糖為底物時mBgaQ的酶活力基本與野生型相同。酶學性質表明,mBgaQ的最適溫度為50℃,在37℃～45℃能發(fā)揮活性,對高溫的耐受性顯著下降;最適pH為8.5,在酸性和中性環(huán)境下穩(wěn)定性較好,在堿性環(huán)境下穩(wěn)定性下降。Na+、K+和Mg2+促進酶活,Zn2+、Ni2++、Mn2+和Co2+抑制酶活,且該酶對Cu2+不耐受。轉糖基優(yōu)化結果顯示,mBgaQ生成GOS的最佳乳糖濃度為25%,最佳pH為6.5,最佳反應溫度為42℃。優(yōu)化后的反應條件為:115%乳糖濃度、pH=6.5、50℃下反應5h,最終生成GOS的轉化率為58.3±1.4%,與野生型相比提高了 13%。另外,本文檢測了低乳糖濃度時mBgaQ與BgaQ生成GOS量以及殘留半乳糖量的時間曲線,發(fā)現(xiàn)mBgaQ生成GOS的轉化率最高為26.7±0.5%,比BgaQ提高了6%,其殘留的半乳糖量也低于BgaQ。4.基于烯醉化酶建立嗜熱鏈球菌的表面展示系統(tǒng)烯醇化酶是糖酵解途徑的關鍵酶,不僅能在胞質內發(fā)揮活性,還能分泌到細胞表面,是一種間歇蛋白(moonlighting protein)。本文從Sthermophilus CGMCC7.1 79的基因組中找出烯醇化酶編碼基因eno M,將EnoM蛋白序列與致病性鏈球菌的烯醇化酶蛋白序列進行了比對分析,發(fā)現(xiàn)具有高度同源性,這表明其烯醇化酶具有表面展示的潛能。隨后我們用pET28a(+)質粒分別將GFP蛋白和GFP-EnoM融合蛋白在E.coli DE3中過表達并純化,結合反應結果顯示,與GFP-EnoM融合蛋白孵育的菌體細胞熒光強度顯著提高,說明EnoM將GFP蛋白錨定在細胞表面。為了探索EnoM的錨定原理,用不同化學試劑處理菌體細胞,發(fā)現(xiàn)經過SDS處理的細胞基本檢測不到熒光,表明EnoM與細胞表面的蛋白質結合。對EnoM在乳酸菌中的適用性進行探究,發(fā)現(xiàn)其在其它乳酸菌中也具有表面錨定功能。為了進一步證實EnoM的表面展示功能,將分子量較大的β-半乳糖苷酶mBgaQ展示到嗜熱鏈球菌的表面并保持了酶的活性,固定化酶在反復利用8次后仍然維持64%的酶活。為了驗證EnoM能否在嗜熱鏈球菌中實現(xiàn)靶向表達,構建了S.thermophilus CGMCC7.179/pLEISS-D2-gfp-enoM重組菌株,提取其胞內蛋白和表面蛋白進行Western Blot檢測,發(fā)現(xiàn)GFP-EnoM蛋白成功表達但是沒有錨定到細胞表面,可能與分泌量不足或者嗜熱鏈球菌致病性的缺失有關。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TS201.3
【圖文】：

物活性物質打力的備選者（Ｂｅｒｍｕｄｅｚ－Ｈｕｍａｒａｎ邋ｅｔ邋ａＬ邋２０丨３）。重組酶在乳酸菌中表達后存逡逑三種去向：運輸?shù)郊毎|、分泌到胞外或錨定到細胞表面。在胞內過量表達目的蛋白會逡逑對宿主的生長和代謝產生負擔（Ｍｉｎｎｉｎｇｅｔａｌ．ＪＯＯｌ），而蛋白分泌到環(huán)境中會被稀釋并且逡逑易于被降解，同T環(huán)境中的ｐＨ值和膽鹽都會降低酶的活性（Ｂｅｍｕｉｄｅｚ－Ｈｉｉｍａｒａｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，逡逑２００４），而錨定到細菌表面尤其是細菌細胞壁能夠更好地保護異源蛋白。因此將蛋白錨逡逑定在微生物表面維持酶的活性并且增加其濃度成為近年來研宄的熱點。逡逑１．４．１表面展示的基本原理及應用逡逑異源蛋白在乳酸菌中的表面展示通過共價結合或非共價結合完成，前者包括Ｎ端的逡逑跨膜結構域錨定模型、脂蛋白錨定模型、ＬＰＸＴＧ模型，后者是指基于ＬｙｓＭ結構域的逡逑錨定模型和表層蛋白（ｓｕｒｆａｃｅｌａｙｅｒｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＳＬＰｓ）同源描定模型（圖１－３）。值得注意逡逑的是，不同的表面展示系統(tǒng)會＾？？致＋邋Ｍ的錨定效率并對宿主菌產生不同的影響（Ｋａｊｉｋａｗａ逡逑ｅｔ邋ａＬ邋２０１１），因此當進行表面展示時需要探宄并評估不同表面展示方法的效果以尋找最逡逑優(yōu)的表面展示策略。逡逑

嗜熱鏈球菌的劃線活化，４２°Ｃ靜置培養(yǎng)２４邋ｈ后觀察菌落，發(fā)現(xiàn)均呈藍色，且變藍色的程逡逑度不同，說明嗜熱鏈球菌能夠產生Ｐ－半乳糖苷酶且不同菌株之間的Ｐ－半乳糖苷酶的活性逡逑存在差異（圖２－１）。逡逑■邋■國逡逑ＳＤＭＣＣ０５０２３６邐ＳＤＭＣＣ０５０２５７邐ＳＤＭＣＣ０５０２２０逡逑瞻~|逡逑ＳＤＭＣＣ０５０２３７邐ＳＤＭＣＣ０５０２４２邐ＳＤＭＣＣ０５０２２９逡逑圖２－１產ｐ－半乳糖苷酶的嗜熱鏈球菌篩選結果。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１邋Ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ邋ｏｆ邋Ｓ．邋ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ邋ｓｔｒａｉｎｓ邋ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ邋（３－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ．逡逑２．２．２嗜熱鏈球菌ｐ－半乳糖苷酶活性的檢測逡逑通過Ｘ－Ｇａｌ平板篩選法對嗜熱鏈球菌產Ｐ－半乳糖苷酶的能力進行了初步檢測，為了逡逑對其Ｐ－半乳糖苷酶的酶活力進行測定，將嗜熱鏈球菌細胞破碎并獲得胞內破碎上清，以逡逑ｏＮＰＧ為底物，檢測卩－半乳糖苷酶的活性。結果如圖２－２所示，不同的嗜熱鏈球菌其胞逡逑內（３－半乳糖苷酶的活性存在一定的差異，體現(xiàn)了菌株的特異性。逡逑１０ｒ逡逑Ｋ邋■逡逑Ｉ邋６逡逑ａ．逡逑Ｃ＿逡逑—邐—邋—邋ｗ＊．邋—逡逑ｒ＾ｌ邋ｒ－ｌ邋ｒ邋Ｊ邋ｒ＇ｌ邐ｒ＾ｔ邋ｆ－＇ｉ邐ｒ＾ｉ邋ｒ＾ｉ邋ｎ邋ｒ＾ｔ邋ｒ￣４邐ｒ＾ｔ邐ｒ邋ｉ邋ｒ－ｔ邐ｒ－ｔ邐ｒ－ｔ邐ｒ邐ｉ逡逑｜｜邋｜邋｜邋｜邋｜邋｜邋｜邋｜邋｜邋｜邋｜邋Ｉ邋Ｉ邋｜邋ｉ邋Ｉ邋１邋§邋§邋｜邋Ｉ邋｜邋§邋｜邋Ｉ邋§邋§逡逑Ｗ邋ｗ邋ｗ邋ｗ逡逑７邋７邋＾邋７邋７

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