【摘要】：嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)是一類重要的食品安全級(jí)菌株,常用于酸奶或奶酪等乳制品的生產(chǎn)。嗜熱鏈球菌利用胞內(nèi)的β-半乳糖苷酶將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖,前者通過糖酵解途徑轉(zhuǎn)化成乳酸,而后者不能被消耗并全部泵到細(xì)胞外,導(dǎo)致乳制品中殘留了大量的半乳糖和部分未被利用的乳糖,不利于人類健康。除此之外,β-半乳糖苷酶還能夠發(fā)揮轉(zhuǎn)糖基活性生成低聚半乳糖(GOS),減少發(fā)酵乳中半乳糖的殘留。因此,調(diào)節(jié)其分解活性與轉(zhuǎn)糖基活性有助于生產(chǎn)低糖健康的乳制品,然而對(duì)其轉(zhuǎn)糖基活性的相關(guān)位點(diǎn)少有報(bào)道,限制了其在食品工業(yè)的應(yīng)用。近年來,由于細(xì)胞固定化酶有更好的催化活性和穩(wěn)定性,乳酸菌表面展示系統(tǒng)得到迅速發(fā)展,而關(guān)于嗜熱鏈球菌表面展示系統(tǒng)的報(bào)道較少。本文主要利用生物信息學(xué)分析對(duì)S.thermophilusSDMCC050237的β-半乳糖苷酶進(jìn)行理性改造,從而提高其轉(zhuǎn)糖基活性,同時(shí)鑒定并研究了嗜熱鏈球菌的烯醇化酶的表面錨定功能及用于表面展示的潛力。具體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.嗜熱鏈球菌中高活性p-半乳糖苷酶的篩選β-半乳糖苷酶對(duì)嗜熱鏈球菌的食品工業(yè)應(yīng)用有重要意義。本文使用X-Gal平板檢測(cè)了嗜熱鏈球菌產(chǎn)β-半乳糖苷酶的能力并以oNPG為底物檢測(cè)了酶活,發(fā)現(xiàn)不同菌株的β-半乳糖苷酶之間存在活性差異。將活性較高的細(xì)胞破碎液與乳糖溶液混合反應(yīng)后利用TLC法初步分析了反應(yīng)液中糖的成分,結(jié)果表明,不同菌株的β-半乳糖苷酶在自然條件下轉(zhuǎn)糖基活性較弱且無明顯差距,導(dǎo)致其發(fā)酵液中殘留了較多的半乳糖。2.β 半乳糖苷酶BgaQ的酶學(xué)性質(zhì)研究及其轉(zhuǎn)糖基活性條件的優(yōu)化以 S.thermophilus SDMCC050237為材料,克隆其β-半乳糖苷酶基因bgaQ,使用表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)在E.coli DE3中過表達(dá)BgaQ蛋白。鎳柱親和層析純化后獲得目標(biāo)蛋白(113 kDa)。以oNPG和乳糖為底物時(shí)BgaQ的酶活分別為4725.3±155.4 U/mg和88.3±1.4U/mg。酶學(xué)性質(zhì)表明,BgaQ的最適溫度為50℃,溫度耐受范圍為37℃～60℃,高溫下穩(wěn)定性下降;最適pH為8.5,pH值穩(wěn)定性較高。另外,Na-、K-、Mg2-、Ba2+和Co2+促進(jìn)酶活,而Fe2+、Ni2-和Co2+抑制酶活,該酶對(duì)Zn2-和Cu2-不耐受。轉(zhuǎn)糖基活性的條件優(yōu)化結(jié)果表明,該酶生成GOS的最優(yōu)乳糖濃度為25%,最優(yōu)溫度為50℃,最優(yōu)pH為6.5。優(yōu)化后的反應(yīng)條件為15%的乳糖濃度,pH=6.5,50℃條件下反應(yīng)5 h,GOS的轉(zhuǎn)化率為45.0±3.4%。3.定點(diǎn)突變提高β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)糖基活性嗜熱鏈球菌的β-半乳糖苷酶具有分解活性和轉(zhuǎn)糖基活性,其工業(yè)應(yīng)用具有重要意義和廣闊前景。為了提高嗜熱鏈球菌β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)糖基活性,本文對(duì)篩選出的β-半乳糖苷酶BgaQ進(jìn)行同源建模,通過序列疊合找到了兩個(gè)谷氨酸活性位點(diǎn),以β-3'-galactosyl-lactose為底物進(jìn)行Autodocking分析,獲得轉(zhuǎn)糖基活性相關(guān)位點(diǎn)并通過序列比對(duì)分析成功構(gòu)建了Y801H/P802G突變體蛋白mBgaQ。以oNPG和乳糖為底物測(cè)得mBgaQ的酶活力分別為5957.7±209.1 U/mg和81.9±3.6 U/mg,以乳糖為底物時(shí)mBgaQ的酶活力基本與野生型相同。酶學(xué)性質(zhì)表明,mBgaQ的最適溫度為50℃,在37℃～45℃能發(fā)揮活性,對(duì)高溫的耐受性顯著下降;最適pH為8.5,在酸性和中性環(huán)境下穩(wěn)定性較好,在堿性環(huán)境下穩(wěn)定性下降。Na+、K+和Mg2+促進(jìn)酶活,Zn2+、Ni2++、Mn2+和Co2+抑制酶活,且該酶對(duì)Cu2+不耐受。轉(zhuǎn)糖基優(yōu)化結(jié)果顯示,mBgaQ生成GOS的最佳乳糖濃度為25%,最佳pH為6.5,最佳反應(yīng)溫度為42℃。優(yōu)化后的反應(yīng)條件為:115%乳糖濃度、pH=6.5、50℃下反應(yīng)5h,最終生成GOS的轉(zhuǎn)化率為58.3±1.4%,與野生型相比提高了 13%。另外,本文檢測(cè)了低乳糖濃度時(shí)mBgaQ與BgaQ生成GOS量以及殘留半乳糖量的時(shí)間曲線,發(fā)現(xiàn)mBgaQ生成GOS的轉(zhuǎn)化率最高為26.7±0.5%,比BgaQ提高了6%,其殘留的半乳糖量也低于BgaQ。4.基于烯醉化酶建立嗜熱鏈球菌的表面展示系統(tǒng)烯醇化酶是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶,不僅能在胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮活性,還能分泌到細(xì)胞表面,是一種間歇蛋白(moonlighting protein)。本文從Sthermophilus CGMCC7.1 79的基因組中找出烯醇化酶編碼基因eno M,將EnoM蛋白序列與致病性鏈球菌的烯醇化酶蛋白序列進(jìn)行了比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)具有高度同源性,這表明其烯醇化酶具有表面展示的潛能。隨后我們用pET28a(+)質(zhì)粒分別將GFP蛋白和GFP-EnoM融合蛋白在E.coli DE3中過表達(dá)并純化,結(jié)合反應(yīng)結(jié)果顯示,與GFP-EnoM融合蛋白孵育的菌體細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著提高,說明EnoM將GFP蛋白錨定在細(xì)胞表面。為了探索EnoM的錨定原理,用不同化學(xué)試劑處理菌體細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過SDS處理的細(xì)胞基本檢測(cè)不到熒光,表明EnoM與細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)結(jié)合。對(duì)EnoM在乳酸菌中的適用性進(jìn)行探究,發(fā)現(xiàn)其在其它乳酸菌中也具有表面錨定功能。為了進(jìn)一步證實(shí)EnoM的表面展示功能,將分子量較大的β-半乳糖苷酶mBgaQ展示到嗜熱鏈球菌的表面并保持了酶的活性,固定化酶在反復(fù)利用8次后仍然維持64%的酶活。為了驗(yàn)證EnoM能否在嗜熱鏈球菌中實(shí)現(xiàn)靶向表達(dá),構(gòu)建了S.thermophilus CGMCC7.179/pLEISS-D2-gfp-enoM重組菌株,提取其胞內(nèi)蛋白和表面蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè),發(fā)現(xiàn)GFP-EnoM蛋白成功表達(dá)但是沒有錨定到細(xì)胞表面,可能與分泌量不足或者嗜熱鏈球菌致病性的缺失有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TS201.3
【圖文】：

物活性物質(zhì)打力的備選者（Ｂｅｒｍｕｄｅｚ－Ｈｕｍａｒａｎ邋ｅｔ邋ａＬ邋２０丨３）。重組酶在乳酸菌中表達(dá)后存逡逑三種去向：運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)、分泌到胞外或錨定到細(xì)胞表面。在胞內(nèi)過量表達(dá)目的蛋白會(huì)逡逑對(duì)宿主的生長和代謝產(chǎn)生負(fù)擔(dān)（Ｍｉｎｎｉｎｇｅｔａｌ．ＪＯＯｌ），而蛋白分泌到環(huán)境中會(huì)被稀釋并且逡逑易于被降解，同T環(huán)境中的ｐＨ值和膽鹽都會(huì)降低酶的活性（Ｂｅｍｕｉｄｅｚ－Ｈｉｉｍａｒａｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，逡逑２００４），而錨定到細(xì)菌表面尤其是細(xì)菌細(xì)胞壁能夠更好地保護(hù)異源蛋白。因此將蛋白錨逡逑定在微生物表面維持酶的活性并且增加其濃度成為近年來研宄的熱點(diǎn)。逡逑１．４．１表面展示的基本原理及應(yīng)用逡逑異源蛋白在乳酸菌中的表面展示通過共價(jià)結(jié)合或非共價(jià)結(jié)合完成，前者包括Ｎ端的逡逑跨膜結(jié)構(gòu)域錨定模型、脂蛋白錨定模型、ＬＰＸＴＧ模型，后者是指基于ＬｙｓＭ結(jié)構(gòu)域的逡逑錨定模型和表層蛋白（ｓｕｒｆａｃｅｌａｙｅｒｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＳＬＰｓ）同源描定模型（圖１－３）。值得注意逡逑的是，不同的表面展示系統(tǒng)會(huì)＾？？致＋邋Ｍ的錨定效率并對(duì)宿主菌產(chǎn)生不同的影響（Ｋａｊｉｋａｗａ逡逑ｅｔ邋ａＬ邋２０１１），因此當(dāng)進(jìn)行表面展示時(shí)需要探宄并評(píng)估不同表面展示方法的效果以尋找最逡逑優(yōu)的表面展示策略。逡逑

嗜熱鏈球菌的劃線活化，４２°Ｃ靜置培養(yǎng)２４邋ｈ后觀察菌落，發(fā)現(xiàn)均呈藍(lán)色，且變藍(lán)色的程逡逑度不同，說明嗜熱鏈球菌能夠產(chǎn)生Ｐ－半乳糖苷酶且不同菌株之間的Ｐ－半乳糖苷酶的活性逡逑存在差異（圖２－１）。逡逑■邋■國逡逑ＳＤＭＣＣ０５０２３６邐ＳＤＭＣＣ０５０２５７邐ＳＤＭＣＣ０５０２２０逡逑瞻~|逡逑ＳＤＭＣＣ０５０２３７邐ＳＤＭＣＣ０５０２４２邐ＳＤＭＣＣ０５０２２９逡逑圖２－１產(chǎn)ｐ－半乳糖苷酶的嗜熱鏈球菌篩選結(jié)果。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１邋Ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ邋ｏｆ邋Ｓ．邋ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ邋ｓｔｒａｉｎｓ邋ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ邋（３－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ．逡逑２．２．２嗜熱鏈球菌ｐ－半乳糖苷酶活性的檢測(cè)逡逑通過Ｘ－Ｇａｌ平板篩選法對(duì)嗜熱鏈球菌產(chǎn)Ｐ－半乳糖苷酶的能力進(jìn)行了初步檢測(cè)，為了逡逑對(duì)其Ｐ－半乳糖苷酶的酶活力進(jìn)行測(cè)定，將嗜熱鏈球菌細(xì)胞破碎并獲得胞內(nèi)破碎上清，以逡逑ｏＮＰＧ為底物，檢測(cè)卩－半乳糖苷酶的活性。結(jié)果如圖２－２所示，不同的嗜熱鏈球菌其胞逡逑內(nèi)（３－半乳糖苷酶的活性存在一定的差異，體現(xiàn)了菌株的特異性。逡逑１０ｒ逡逑Ｋ邋■逡逑Ｉ邋６逡逑ａ．逡逑Ｃ＿逡逑—邐—邋—邋ｗ＊．邋—逡逑ｒ＾ｌ邋ｒ－ｌ邋ｒ邋Ｊ邋ｒ＇ｌ邐ｒ＾ｔ邋ｆ－＇ｉ邐ｒ＾ｉ邋ｒ＾ｉ邋ｎ邋ｒ＾ｔ邋ｒ￣４邐ｒ＾ｔ邐ｒ邋ｉ邋ｒ－ｔ邐ｒ－ｔ邐ｒ－ｔ邐ｒ邐ｉ逡逑｜｜邋｜邋｜邋｜邋｜邋｜邋｜邋｜邋｜邋｜邋｜邋Ｉ邋Ｉ邋｜邋ｉ邋Ｉ邋１邋§邋§邋｜邋Ｉ邋｜邋§邋｜邋Ｉ邋§邋§逡逑Ｗ邋ｗ邋ｗ邋ｗ逡逑７邋７邋＾邋７邋７

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