【摘要】：次黃嘌呤(Hypoxanthine,I)是DNA中一種常見(jiàn)的損傷堿基,主要來(lái)源于腺嘌呤的脫氨基作用,具有致突變性。高溫加劇了腺嘌呤脫氨基形成I的速率,暗示著極端嗜熱古菌基因組DNA的穩(wěn)定性受到嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。核酸內(nèi)切酶是驅(qū)動(dòng)DNA中I修復(fù)的關(guān)鍵酶。但是,目前極端嗜熱古菌DNA中I的修復(fù)機(jī)制尚不清楚。極端嗜熱古菌 Termococcus barophilus 和Thermococcus gammatolerans均分離自深海熱液口,其最適生長(zhǎng)溫度為85℃左右。這兩種古菌基因組DNA的測(cè)序已經(jīng)完成,均編碼了核酸內(nèi)切酶V(EndoV)和核酸內(nèi)切酶NucS。本論文分別以Tba EndoV和Tga NucS這兩種核酸內(nèi)切酶為研究對(duì)象,研究了它們切割I(lǐng)-DNA的生化性質(zhì),并初步探討了 Tga NucS的催化機(jī)理。本論文的第一部分內(nèi)容主要開(kāi)展了 Tba EndoV和Tga NucS基因克隆、誘導(dǎo)表達(dá)及純化的研究。首先,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增了 Tba EndoV和Tga NucS的基因,進(jìn)一步將其克隆至pET-30a(+)表達(dá)載體中。利用熱激法將含有目的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株的感受態(tài)細(xì)胞。通過(guò)加入誘導(dǎo)物IPTG(Isopropyl β-D-Thiogalactoside)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白,然后經(jīng)過(guò)熱處理、Ni柱親和純化等步驟純化得到Tba EndoV和Tga NucS 蛋白。本論文的第二部分內(nèi)容研究了 Tba EndoV切割I(lǐng)-DNA的生化性質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn),Tba EndoV不能夠切割正常DNA和U-DNA,而能夠切割I(lǐng)-DNA。該酶切割I(lǐng)-ssDNA反應(yīng)的最適溫度為50～90℃。經(jīng)過(guò)100℃處理90 min后,Tba EndoV切割I(lǐng)-ssDNA的效率仍為90%,表明該酶為極其熱穩(wěn)定性的核酸內(nèi)切酶。此外,我們還發(fā)現(xiàn)Tba EndoV切割I(lǐng)-ssDNA反應(yīng)的最適pH為7.5～9.0。該酶切割I(lǐng)-ssDNA時(shí)需要二價(jià)金屬離子,具體表現(xiàn)為Ni2+、Mg2+和Mn2+存在時(shí),Tba EndoV能夠切割I(lǐng)-ssDNA,其切割效率為Mn2+Mg2+Ni2+。Tba EndoV能夠耐受300 mM的NaCl濃度,但更高濃度的NaCl(500 mM)會(huì)抑制該酶的酶活。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),Tba EndoV在相同溫度條件下切割I(lǐng)-ssDNA的能力要高于其切割I(lǐng)-dsDNA的能力。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Tba EndoV結(jié)合I-ssDNA的能力要強(qiáng)于其結(jié)合I-dsDNA的能力。因此,該酶傾向于識(shí)別和切割ssDNA中的I。本論文的第三部分內(nèi)容關(guān)于Tga NucS切割I(lǐng)-DNA生化性質(zhì)的研究。研究發(fā)現(xiàn),Tga NucS能夠在55℃切割I(lǐng)-ssDNA,而在80℃切割I(lǐng)-dsDNA。此外,Tga NucS切割I(lǐng)-dsDNA反應(yīng)的最適溫度為75～80℃,最適pH為pH 7.0～9.0。該酶切割I(lǐng)-dsDNA需要二價(jià)金屬離子,其中Mn2+和Mg2+為其最適金屬離子。另外,高鹽會(huì)抑制Tga NucS切割I(lǐng)-dsDNA。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),Tga NucS與限制性核酸內(nèi)切酶類似,均能夠?qū)NA兩條鏈進(jìn)行切割,其切割位置為次黃嘌呤的5'端第二個(gè)磷酸二酯鍵和互補(bǔ)鏈中對(duì)應(yīng)模板堿基T的5'端第三個(gè)磷酸二酯鍵。因此,該酶的切割產(chǎn)物為5'端含有4個(gè)核苷酸長(zhǎng)度突出末端的斷裂雙鏈DNA。對(duì)Tga NucS切割產(chǎn)物的再連接實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)該酶切割產(chǎn)物能夠被T4DNA連接酶所連接,表面其切割產(chǎn)物具有3'OH和5'P末端。與野生型Tga NucS蛋白相比,D163A突變體蛋白不能夠切割I(lǐng)-dsDNA,而E177A突變體蛋白的切割效率僅為18%。因此,D163為該酶的關(guān)鍵活性位點(diǎn)之一。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,D163A突變體蛋白結(jié)合I-dsDNA的效率為68%,低于野生型Tga NucS蛋白的結(jié)合效率。另外,E177A突變體蛋白結(jié)合I-dsDNA的效率與野生型蛋白相接近。因此,D163同時(shí)參與該酶切割和結(jié)合dsDNA,而E177不參與該酶結(jié)合dsDNA,但會(huì)參與該酶切割dsDNA。本論文揭示了 Tba EndoV和Tga NucS切割I(lǐng)-DNA的生化性質(zhì),并初步探討了Tga NucS的催化機(jī)理。本論文的研究成果,為闡明極端嗜熱古菌DNA中次黃嘌呤的修復(fù)提供了重要的線索,也為揭示極端嗜熱古菌中損傷DNA修復(fù)機(jī)制提供依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q78;Q55
【圖文】：

小亞基序列之后，發(fā)現(xiàn)它們的１６ｓ邋ｒＲＮＡ序列相似性均小于６０％，從而提出三域?qū)W說(shuō)。三逡逑域?qū)W說(shuō)將生命劃分為真核生物域（Ｅｕｃａｒｙａ）、細(xì)菌域（Ｂａｃｔｅｒｉａ）和古菌域（Ａｒｃｈａｅａ）邋［４］。逡逑Ｃａｒｌ邋Ｗｏｅｓｅ最初提出的三域?qū)W說(shuō)將古菌主要分為廣古菌和泉古菌（圖１．１）。隨著分子逡逑生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的古菌被發(fā)現(xiàn)�；冢保叮渝澹颍遥危列蛄袛�(shù)據(jù)，Ｋａｒｌ邋Ｓｔｅｔｔｅｒ構(gòu)建逡逑了三域系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖１．２）邋［５］，從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)來(lái)看，古菌和細(xì)菌所在的分叉點(diǎn)所顯示的生逡逑命剛好是極端嗜熱古菌，同處于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的底部，暗示著極端嗜熱古菌很可能是在生物逡逑進(jìn)化史上最接進(jìn)先祖的生物［６］，因此，研[偧聳熱裙啪暈頤橇私夤爬仙慕推皰義顯淳哂兄匾淖饔謾ｅ義希攏幔悖簦澹潁椋徨危粒潁悖瑁幔澹徨危牛酰悖幔潁徨義�？逦｜邋Ｅｕ}幔潁洌�？ｅP簦徨危苠澹懾澹�？辶x希危簀澹�？逦１_危鄭蓿保峰義希村危澹茫睿睿幔潁悖瑁幔澹錚簦徨澹保保苠危危掊巍保板義賢跡保卞澹茫幔潁戾澹祝錚澹螅逄岢齙娜蜓擔(dān)保矗卞義希疲椋紓澹保卞澹裕瑁邋澹簦瑁澹錚潁澹錚駑澹簦瑁潁澹澹洌錚恚幔椋鑠澹穡潁錚穡錚螅澹溴澹猓澹茫幔潁戾澹祝錚澹螅邋義

本文編號(hào)：2737153