【摘要】：微生物纖維素酶可以將纖維素轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的糖類,已被廣泛應(yīng)用在能源、飼料、造紙等多個(gè)行業(yè)。從微生物基因組中挖掘具有應(yīng)用潛力的新型纖維素酶,并通過(guò)分子改良提高其應(yīng)用性能具有重要意義。本研究以真菌Talaromyces leycettanus JCM12802、Bispora sp.MEY-1、Bispora antennata CBS126.38、Gloeophyllum trabeum CBS900.73、Stegonsporium opalus CBS125034為出發(fā)菌株,克隆表達(dá)了糖苷水解酶第五家族(GH5)纖維素酶及具有纖維素酶活性的膨脹素蛋白�；诘鞍撞煌Y(jié)構(gòu)層次的分析,采用半桶融合、二級(jí)結(jié)構(gòu)單元替換、定點(diǎn)突變等技術(shù),系統(tǒng)的研究了 GH5纖維素酶結(jié)構(gòu)原件及特定氨基酸位點(diǎn)與酶功能之間的關(guān)系,闡明了纖維素酶的穩(wěn)定性及催化機(jī)制。從上述5株真菌中成功克隆、表達(dá)了 7個(gè)GH5纖維素酶,獲得重組蛋白TlCe15A,TlCe15B,BsCel5A,BsCel5B,GtCe15,SoCel5,BaCel5,其最適溫度在 50-80℃ 之間,最適pH在3.0-5.0之間,為酸性纖維素酶。其中,TlCe15A和BsCel5B為嗜熱纖維素酶,最適溫度為80℃,在70℃ 下的穩(wěn)定性較好。TlCe15B最適pH為3.0,在酸性條件下的穩(wěn)定性較好。在催化底物多樣性方面,上述7個(gè)蛋白均對(duì)Barley β-glucan、Lichenan、CMC-Na表現(xiàn)出高活性。其中,BsCel5B具有較高的纖維素酶活性(1164 U/mg)和甘露聚糖酶活性(2203 U/mg),其甘露聚糖酶活性高于目前報(bào)道的其他纖維素酶。SoCel5(最適溫度 60℃)與來(lái)源于Talaromyces emersonii CBS394.64 的 TeEg15A(最適溫度90℃)的序列一致性為51%,基于二者的二級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn),進(jìn)行結(jié)構(gòu)重組,構(gòu)建10個(gè)雜合蛋白,H1-H10。其中H8和H9最適溫度分別為80℃和70℃,在55℃下的半衰期分別達(dá)到親本蛋白SoCel5的650和155倍。此外,H8和H9的比活值分別為 720U/mg 和 920U/mg,均高于兩個(gè)親本 SoCel5(350U/mg)和 TeEgl5A(600U/mg)。分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果表明,N端區(qū)域中Arg52點(diǎn)與周圍氨基酸的氫鍵作用力以及α2和a3結(jié)構(gòu)之間的疏水堆積力對(duì)嗜熱酶的熱穩(wěn)定性發(fā)揮重要作用,使蛋白結(jié)構(gòu)在高溫下保持穩(wěn)定。將TeEg15A的N端半桶結(jié)構(gòu)(βα)1-4和3/8桶結(jié)構(gòu)(βa)1-3分別替換至BaCe15,構(gòu)建兩個(gè)雜合酶BaCe15127和BaCe15167,其比活性和催化效率提高了 1.0-6.7倍。結(jié)構(gòu)模擬的結(jié)果表明,BaCe15127和BaCel5167催化通道整體構(gòu)型較BaCel5發(fā)生明顯變化,有利于底物的結(jié)合和產(chǎn)物的釋放,同時(shí)催化殘基之間的距離也分別縮小了 2.5A和1.8A,有利于對(duì)底物的切割。此外,TeEg15A的N端半桶結(jié)構(gòu)還為雜合酶引入了更多的氫鍵作用力,促進(jìn)酶與底物的結(jié)合。通過(guò)本研究,證明了 TeEgl5A的N端半桶結(jié)構(gòu)對(duì)酶的催化活性的重要影響,同時(shí)成功的對(duì)BaCel5的催化效率進(jìn)行了改良。對(duì)GtCel5的Asn233位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變研究,該位點(diǎn)參與loop 6上的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成。通過(guò)對(duì)突變體性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn),N233G和N233A 比活力和催化效率較野生型提高了 26-70%。以TeEg15A和SoCe15作為對(duì)照研究,其突變體的活力結(jié)果為GlyAlaAsn,與GtCel5突變結(jié)果一致。同源建模、分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)分析結(jié)果表明,233位點(diǎn)間接地影響了催化殘基Glu267周圍的氫鍵作用力網(wǎng)絡(luò)。此外,Ala和Gly為233位點(diǎn)增加了新的氫鍵作用力,其與底物的結(jié)合能也顯著降低。該研究闡明了 loop 6區(qū)對(duì)GH5纖維素酶催化活性的影響機(jī)制。從T.leycettanus基因組中克隆了 1個(gè)具有纖維素酶活性的膨脹素編碼基因,獲得重組蛋白TlSWO�；钚詼y(cè)定結(jié)果表明,TlSWO對(duì)β-1,4鍵連接的纖維素類底物具有降解能力,其最適pH為4.0,最適溫度為60℃。以預(yù)處理的天然玉米秸稈PCS為底物,TlSWO與Trichodermalongibrachiatu來(lái)源的內(nèi)切纖維素酶EGI之間的添加比例達(dá)到1.2:0.8時(shí)的協(xié)同效果最優(yōu)。以磷酸溶脹微晶纖維素PASC以及高度結(jié)晶纖維素CNC為底物,TISWO與來(lái)源于T.reesei外切纖維素酶CBHI的協(xié)同轉(zhuǎn)化效率分別提高了 9.6%和30%。通過(guò)該部分的研究使我們對(duì)真菌膨脹素蛋白有了新的認(rèn)識(shí)。
【學(xué)位授予單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q55
【圖文】：

１．３．３．２邋ＧＨ５纖維素酶催化機(jī)制逡逑由于ＧＨ５是第一個(gè)報(bào)道有纖維素酶的糖苷水解酶家族，因此，也被稱為“纖維素逡逑酶Ａ”家族（Ａｓｐｅｂｏｒｇ，２０１２）。該家族成員采取雙交換催化機(jī)制，其催化原理如圖１．４所逡逑示。逡逑５逡逑

供體和質(zhì)子受體均復(fù)位到初始狀態(tài)，對(duì)其他糖苷鍵再進(jìn)行相同的水解過(guò)程。逡逑１．３．３．３邋ＧＨ５纖維素酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)逡逑第５家族纖維素酶具有相同的結(jié)構(gòu)，Ｓ卩（ｐｏ0８－ＴＩＭ桶狀結(jié)構(gòu)（圖１．５），根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)逡逑道，約１０％的酶具有此類結(jié)構(gòu)（Ｃａｒｓｔｅｎｓｅｎ邋ｄ邋NB，２０１２ｂ）。其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是由８組ｐ折疊逡逑片和ａ螺旋結(jié)構(gòu)單元通過(guò)ａＰ－ｌｏｏｐ連接而成，而每個(gè)結(jié)構(gòu)單元包含一個(gè)（３折疊片和ａ逡逑螺旋結(jié)構(gòu)（Ｐ0０，由ｐａ－ｌｏｏｐ連接。整體結(jié)構(gòu)如圖１．５所示，ＴＩＭ桶狀結(jié)構(gòu)的外圍是８逡逑個(gè)ａ螺旋，內(nèi)壁結(jié)構(gòu)包含８?jìng)�(gè)（３折疊片。ＧＨ５纖維素酶氨基酸序列包含７個(gè)保守的逡逑氨基酸殘基，以來(lái)源于的ＢａＣｅｌ５為例，其保守氨基酸殘基分別為逡逑Ａｒｇ６０，邋Ｈｉｓｌ０４，邋Ａｓｎｌ４３，邋Ｇｌｕｌ４４，邋Ｈｉｓ２１２，邋Ｔｙｒ２１４邋以及邋Ｇｌｕ２５４。其中邋Ｇｌｕｌ４４邋和邋ＧＷ２５４逡逑為該酶的催化殘基

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