發(fā)布時(shí)間：2020-06-29 11:01

【摘要】：現(xiàn)如今,α-淀粉酶大量用于食品、飼料產(chǎn)業(yè)中,本研究試圖通過優(yōu)化枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的信號肽,從而提高淀粉酶產(chǎn)量,解決淀粉酶異源表達(dá)中出現(xiàn)的“瓶頸”。另外,隨著人們對酶制劑應(yīng)用的多元化,希望一個(gè)蛋白具有多種酶學(xué)特性,使生產(chǎn)成本得到降低,因此開發(fā)多功能組合酶制劑將成為一定的趨勢。在研究淀粉酶的基礎(chǔ)上,通過對木聚糖酶和α-淀粉酶融合蛋白共表達(dá)的研究,幫助我們更深刻地了解到共表達(dá)系統(tǒng)的作用機(jī)制,為今后關(guān)于不同酶制劑之間融合蛋白的共表達(dá)提供一些有價(jià)值的參考。1、本研究以曲霉屬(Aspergillus lacticoffeatus)的α-淀粉酶AmyCBS 101883和瘤胃真菌類(Neocallimastix patriciarum)木聚糖酶XynCDBFV作為主要研究對象,利用Linker Database數(shù)據(jù)庫篩選三條適用于糖苷水解酶類的連接肽,通過基因重疊延伸技術(shù)(Splicing by Ovedap Extension,SOE)的手段構(gòu)建出木聚糖酶與α-淀粉酶的共表達(dá)融合蛋白。并將其分別導(dǎo)入大腸桿菌與畢赤酵母中誘導(dǎo)表達(dá)。以單一酶Amy-E2和Amy-pGAP為參照,研究其酶學(xué)特性。結(jié)論如下:在pH適應(yīng)性與穩(wěn)定性方面:Amy-E2與融合蛋白Xyn-Amy-E2中α-淀粉酶最適pH均為7.5,當(dāng)pH低于7.0時(shí)Amy-E2酶活迅速下降,而Xyn-Amy-E2在pH 4.5-7.5之間其相對剩余酶活仍保持在70%以上,在酸性條件下有較好的適應(yīng)性。Linker 1連接的融合蛋白,不僅在pH 6.5及pH 7.5的環(huán)境下相對剩余酶活仍保持在95%左右,pH 8.5堿性條件下的適應(yīng)性也最優(yōu),且使融合蛋白中的α-淀粉酶活性提高了23%。此外,在真核表達(dá)系統(tǒng)中,α-淀粉酶的pH適應(yīng)性均屬中偏堿性,且融合蛋白α-淀粉酶在酸性條件下優(yōu)于參照酶。在溫度適應(yīng)性與穩(wěn)定性方面:Xyn-Amy-E2熱穩(wěn)定性最優(yōu),耐受處理50 min后接近半衰期。融合蛋白Xyn-L2-Amy-pGAP和Xyn-L3-Amy-pGAP在55-70℃范圍內(nèi)有很好的適應(yīng)性,相對剩余酶活在65%以上,優(yōu)于參照酶Amy-pGAP。通過以上融合表達(dá)發(fā)現(xiàn):在同一表達(dá)系統(tǒng)中,融合后表達(dá)的α-淀粉酶活性均低于單一α-淀粉酶。Xyn-Amy、Xyn-L1-Amy、Xyn-L2-Amy、Xyn-L3-Amy分別下降了36.9%、21.6%、59.0%、39.0%。當(dāng)引入連接肽Linker 1時(shí),使融合α-淀粉酶活性提高了23%。大腸桿菌中α-淀粉酶的平均酶活為0.571 U/mL,真核系統(tǒng)中α-淀粉酶的活性為4.208 U/mL。2、本研究以枯草芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)pBE-S為骨架,構(gòu)建來源于解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(DL-3-4-1)的混合信號肽篩選文庫。通過電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到枯草芽孢桿菌(B.subtilis)菌株RIK1285中�；�96孔板微量培養(yǎng),對1920株菌株的發(fā)酵液上清進(jìn)行檢測,對酶活位于前100的菌株進(jìn)行測序。經(jīng)篩選獲得14條優(yōu)化表達(dá)的信號肽:yomL、PhrA、PhrF、YvbX、YoqH、mpr、YuaB、YqxI、YjcM、ywoF、PhrK、peI、YceG、YddT、yobb。其中,引導(dǎo)α-淀粉酶最高效分泌的信號肽yomL,酶活為113.251 U/mL。進(jìn)一步對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析如下:最適pH為6.5,且在中偏堿性條件下的穩(wěn)定性較好,最適溫度為65℃。在65℃、70℃、80℃條件下耐受1 h,其半衰期依次為80 min、70 min、40 min,表明其熱穩(wěn)定性較強(qiáng)。其中Triton x-100、Mn~(2+)、EDTA、Ni~(2+)、Co~(2+)對DL-3-4-1有激活作用;SDS、Al ~(3+)、Cu~(2+)對該酶有一定抑制作用;Ag~+、β-mercaptoethanol對該酶完全抑制。此外,該酶對來自植物種子、根莖類的粗淀粉均有很好的水解作用,有較為廣泛的運(yùn)用價(jià)值。
【學(xué)位授予單位】：云南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q78;Q55
【圖文】：

第 1 章 緒論淀粉。（2）Englyst 等[5]依據(jù)淀粉的生物可利用性，將淀粉分成 3 類：快速消化型淀粉（ReadyDi-gestible Starch,RDS）、緩慢消化型淀粉（SlowlyDigestibleStarch,SDS）和抗性淀粉（Resistant Starch, RS）。（3）根據(jù)淀粉的結(jié)構(gòu)可分為直鏈淀粉和支鏈淀粉。不同植物來源的淀粉中直鏈淀粉和支鏈淀粉所含的比例差異較大，一般直鏈淀粉約占 10%-30%，支鏈淀粉約占 70%-90%[6]。在植物生長代謝過程中，不同植物的直鏈淀粉和支鏈淀粉與一些脂類結(jié)合，以復(fù)雜的組織形式，圍繞中心由內(nèi)向外，形成大小、形狀和結(jié)構(gòu)都不同的淀粉粒，儲存于根莖、種子和果實(shí)的細(xì)胞組織里[7]。1.1.2 淀粉的分子及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

由一個(gè) β-折疊與 DomainA 相連。如圖（1.2）為來自真菌米曲酶 Taka-amylase（TAA），是第一個(gè)被確定三維空間結(jié)構(gòu)的 α-淀粉酶，它具有典型的（β/α）8 TIM 桶狀結(jié)構(gòu)[26]，因此成為 α-淀粉酶研究的模式分子。圖（1.1）中（a）是 TAA 的三維結(jié)構(gòu)；（b）是對（β/α）8 -barre fold α-螺旋與 β-折疊相對位置的解析。在 α-淀粉酶的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上再分析其酶作用的機(jī)制，如下：淀粉酶的催化活性中心由（β/α）8 TIM 桶狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成，即由 N-端肽鏈形成交替排列的各八個(gè) β-折疊和 α-螺旋，在空間上八個(gè) β-折疊排列在內(nèi)，八個(gè) α-螺旋圍繞在外，形成一個(gè)中空的（β/α）8 桶狀結(jié)構(gòu)（TIM-barre），此結(jié)構(gòu)為 α-淀粉酶分子的結(jié)構(gòu)域 A（DomainA）；在 β3 與 α3 之間有一段長約 70 個(gè)氨基酸殘基，形成了結(jié)構(gòu)域 B（Domain B）呈 β-折疊，其中包含 Ca2+離子結(jié)合位點(diǎn)[27]；C-端為 DomainC。β4 的天冬氨酸（Aspartate）、β5 的谷氨酸（Glutamate）、β7的天冬氨酸（Aspartate）分別作為反應(yīng)中的親核劑、質(zhì)子供體及輔助，構(gòu)成酶與底物作用的基礎(chǔ)。在裂解 α-1,4 糖苷鍵的同時(shí)，保留產(chǎn)物末端的 α-構(gòu)型[28,29]。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

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相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

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相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

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本文編號：2733782