【摘要】：真核生物基因轉(zhuǎn)錄如何發(fā)生的是生命科學(xué)研究領(lǐng)域中需要解答的最基本問(wèn)題之一。RNA聚合酶Ⅱ(Pol Ⅱ)指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄起始要求RNA聚合酶Ⅱ、通用轉(zhuǎn)錄因子、輔因子和介導(dǎo)子聚集在基因核心啟動(dòng)子區(qū)并形成預(yù)起始復(fù)合物。以前的研究表明,核心啟動(dòng)子TATA box元件上下游存在轉(zhuǎn)錄因子ⅡB的識(shí)別位點(diǎn)(BRE~(ud)),BRE~(ud)突變導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子ⅡA-TATA box binding protein-DNA(TFⅡA-TBP-DNA)復(fù)合物的形成明顯減少,提示核心啟動(dòng)子區(qū)存在TFⅡA結(jié)合區(qū)并且可能與BRE~(ud)重疊。本課題的主要研究目標(biāo)是:1)確定在核心啟動(dòng)子上是否存在TFⅡA識(shí)別區(qū)域;2)定義TFⅡA識(shí)別元件并確定它在Pol Ⅱ指導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄中的作用;3)研究TFⅡA及其識(shí)別元件互作如何調(diào)節(jié)Pol Ⅱ指導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄。傳統(tǒng)的體外轉(zhuǎn)錄方法是基于放射性同位素標(biāo)記的引物和引物延伸以及應(yīng)用于體外轉(zhuǎn)錄研究的常規(guī)手段。但是,由于放射性的使用,該方法存在諸多缺點(diǎn),限制了它的廣泛應(yīng)用。因此,在這項(xiàng)課題中,我們首先建立了基于定量PCR和特異性引物延伸的非放射性體外轉(zhuǎn)錄新方法。結(jié)果表明,體外轉(zhuǎn)錄體系中的DNA模板能夠被我們研發(fā)的手段有效清除至很低的水平。通過(guò)設(shè)計(jì)獨(dú)特的引物延伸的引物和qPCR引物,引物延伸的產(chǎn)物能被qPCR引物識(shí)別和擴(kuò)增。利用新建立的方法研究TFⅡB下游識(shí)別元件突變(BRE~d)和TFⅡB突變對(duì)adenovirus E4(AdE4)和腺病毒晚期啟動(dòng)子(AdML)啟動(dòng)子活性的影響,獲得的結(jié)果與傳統(tǒng)體外轉(zhuǎn)錄方法的結(jié)果一致。這些結(jié)果證明新的體外轉(zhuǎn)錄方法能夠應(yīng)用于核心啟動(dòng)子元件對(duì)啟動(dòng)子活性的檢測(cè)以及轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的研究。新方法具有簡(jiǎn)單和環(huán)保等優(yōu)點(diǎn),能夠被廣泛應(yīng)用于世界范圍的轉(zhuǎn)錄研究實(shí)驗(yàn)室;同時(shí),也為此項(xiàng)課題的完成提供了一個(gè)方便的實(shí)驗(yàn)手段。如上所述,核心啟動(dòng)子區(qū)BRE~(ud)突變嚴(yán)重影響TFⅡA-TBP-DNA復(fù)合物形成,提示TFⅡA與啟動(dòng)子結(jié)合區(qū)域BRE~(ud)序列存在重疊。為進(jìn)一步確定TFⅡA與啟動(dòng)子DNA的具體結(jié)合區(qū)域,利用純化的人天然TFⅡA蛋白和AdML啟動(dòng)子DNA完成EMSA和甲基化干擾實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,TFⅡA與AdML啟動(dòng)子TATA box上游存在結(jié)合位點(diǎn)。利用這一信息,針對(duì)TFⅡA結(jié)合位點(diǎn)合成含隨機(jī)堿基的AdML DNA文庫(kù)并完成SELEX實(shí)驗(yàn),利用隨機(jī)篩選獲得的結(jié)果我們定義了位于TATA box上游的TFⅡA的識(shí)別元件(ⅡARE)。在這一識(shí)別序列兩端,TFⅡA更傾向于結(jié)合含G或T堿基的DNA序列。利用天然啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明,ⅡARE存在于許多天然啟動(dòng)子中。為證明我們獲得的ⅡARE共同堿基序列是否影響TFⅡA與DNA的結(jié)合以及啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性,我們利用含ⅡARE和不含ⅡARE的啟動(dòng)子進(jìn)行蛋白-DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)、體外轉(zhuǎn)錄和熒光素酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ⅡARE能促進(jìn)TFⅡA在含TATA box啟動(dòng)子上的結(jié)合和含TATA box啟動(dòng)子的基因轉(zhuǎn)錄活性;但ⅡARE抑制無(wú)TATA box啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。利用整合了ⅡARE優(yōu)化型和缺陷型AdML啟動(dòng)子的Flp-In293細(xì)胞系完成ChIP實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)ⅡARE是通過(guò)增加Pol Ⅱ、TFⅡA、TAF4和p300因子在含TATA box啟動(dòng)子上的招募從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的,但是,ⅡARE通過(guò)減少Pol Ⅱ和TAF1因子在無(wú)TATA box啟動(dòng)子上的招募從而抑制轉(zhuǎn)錄。為了明白TFⅡA與ⅡARE之間的互作對(duì)Pol Ⅱ轉(zhuǎn)錄起始組裝和轉(zhuǎn)錄活性的影響,分別突變ⅡARE以及TFⅡAα/β與ⅡARE結(jié)合的潛在位點(diǎn)并完成蛋白-DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,ⅡARE突變影響TFⅡA與AdML啟動(dòng)子DNA結(jié)合,而TFⅡAα/β第348和350位氨基酸突變也明顯影響TFⅡAα/β與AdML啟動(dòng)子結(jié)合。體外轉(zhuǎn)錄和熒光素酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)研究表明,TFⅡAα/β第348和350位氨基酸突變(2SM)抑制AdML啟動(dòng)子和天然啟動(dòng)子的活性,這些結(jié)果提示TFⅡAα/β可能通過(guò)Arg348和Arg350與含ⅡARE啟動(dòng)子DNA結(jié)合參與調(diào)控Pol Ⅱ指導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄。利用沉默內(nèi)源TFⅡAα/β并穩(wěn)定表達(dá)外源HA-TFⅡAα/β或其2SM突變的293T細(xì)胞系完成ChIP實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,表達(dá)TFⅡAα/β突變體(2SM)抑制TFⅡA、TBP、p300和Pol Ⅱ在含ⅡARE啟動(dòng)子上的招募,提示TFⅡAα/β突變通過(guò)減少這些因子在啟動(dòng)子上的結(jié)合從而抑制啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性。這些結(jié)果說(shuō)明阻斷TFⅡAα/β與ⅡARE之間的互作能夠抑制TFⅡA-TBP-DNA復(fù)合物形成和Pol Ⅱ指導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄。綜上所述,在此課題研究中,我們建立了非同位素體外轉(zhuǎn)錄新方法。利用該方法以及其他的分子生物學(xué)手段研究TFⅡA及其識(shí)別元件在Pol Ⅱ指導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄中的調(diào)控作用,探究了TFⅡA及其識(shí)別元件互作對(duì)Pol Ⅱ基因轉(zhuǎn)錄的影響及其調(diào)控機(jī)制。本課題的發(fā)現(xiàn)拓展了TFⅡA以及核心啟動(dòng)子元件在基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄中的作用,為Pol Ⅱ介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供了新的視角。
【學(xué)位授予單位】：武漢科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q75
【圖文】：

武漢科技大學(xué)博士學(xué)位論文的方向，也影響轉(zhuǎn)錄效率，轉(zhuǎn)錄起始被一些研究者認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的限速步驟。研究表明，PICs 在體外的形成效率高，然而，具有轉(zhuǎn)錄活性的 PICs 所占的比例極低，約 2~20%[29]；利用活細(xì)胞成像技術(shù)也觀察到同樣的現(xiàn)象，Pol II 與啟動(dòng)子DNA 結(jié)合后，只有約 1%能產(chǎn)生有效的轉(zhuǎn)錄[30]。這些現(xiàn)象說(shuō)明有活性的復(fù)合物的構(gòu)象研究可能是研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵點(diǎn)；因此，借助單分子系統(tǒng)可能為此項(xiàng)研究提供可行的方法[31]。

真核生物的轉(zhuǎn)錄起始要求 RNA 聚合酶 II 和通用轉(zhuǎn)錄因子聚集在核心啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行組裝并形成轉(zhuǎn)錄預(yù)起始復(fù)合物。核心啟動(dòng)子區(qū)是指覆蓋轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，沿著起始位點(diǎn)上游或者下游約 35bp 的啟動(dòng)子序列。因此，核心啟動(dòng)子約 40 ~ 70 bp。真核生物核心啟動(dòng)子由一系列順式調(diào)控元件（Cis-regulatoryelements）組成，它們包含 TATA box、起始元件（Inr）、TFIIB 識(shí)別元件（BRE）、下游啟動(dòng)子元件（DPE）、MTE 等核心啟動(dòng)子元件，這些核心啟動(dòng)子元件在基因啟動(dòng)子區(qū)上的分布如圖 1.2[24,96]。這些順式調(diào)控元件也稱為核心啟動(dòng)子元件（Corepromoter elements），它們調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成和啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，是RNA 聚合酶 II 轉(zhuǎn)錄器械的活性起點(diǎn)，也是參與調(diào)控 RNA 聚合酶 II 轉(zhuǎn)錄的所有因子的最終作用的靶點(diǎn)。在轉(zhuǎn)錄器形成過(guò)程中，這些元件導(dǎo)引通用轉(zhuǎn)錄因子向核心啟動(dòng)子聚集。這一過(guò)程需要通過(guò) TFIID 的 TBP 亞基識(shí)別 TATAbox，TAF1 和TAF2 亞基識(shí)別 Inr 和 MTE，TAF6 和 TAF9 亞基識(shí)別 DPE 以及 TFIIB 識(shí)別 BREu和 BREd來(lái)實(shí)現(xiàn)（圖 1.1 和圖 1.2）[24]。大量研究表明，核心啟動(dòng)子元件不僅調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的起始組裝，也影響轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的選擇，轉(zhuǎn)錄的定向和轉(zhuǎn)錄的效率[97]。

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