發(fā)布時(shí)間：2020-06-26 17:25

【摘要】：脂肪酶能夠水解脂肪,形成脂肪酸等風(fēng)味前體物質(zhì),是一種廣泛應(yīng)用的催化劑。實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明,豬肉內(nèi)源性脂肪酶對(duì)肉品及奶制品的風(fēng)味均有所改善,為進(jìn)一步驗(yàn)證脂肪酶功能,本文從豬肉中克隆了脂肪酶基因LPL,并在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá),考察重組脂肪酶對(duì)豬肉、奶制品、淀粉作用效果,從分子水平和酶水平解析豬肉脂肪酶對(duì)食品風(fēng)味的作用機(jī)制,為脂肪酶工業(yè)化生產(chǎn)提供新思路。研究結(jié)果如下:1.根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的LPL基因序列,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到LPL基因,測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì),同源性為99%,構(gòu)建的LPL基因大小為1756 bp,編碼478個(gè)氨基酸。構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET30a-LPL在大腸桿菌中成功表達(dá)。重組菌在IPTG濃度為0.4 mM,誘導(dǎo)時(shí)間5 h時(shí)達(dá)到最大表達(dá)量,溫度對(duì)表達(dá)量的影響較小。經(jīng)鎳柱親和層析純化得到一條單一的目的條帶,與預(yù)測(cè)重組蛋白理論分子量大小一致為53.58 kDa。經(jīng)測(cè)定重組酶蛋白濃度為189μg/mL,酶活力為0.932 U/mL。重組酶pH穩(wěn)定性良好,最適pH和最適溫度分別為pH 8.0和40℃,且對(duì)于低濃度的甲醇、丙三醇,重組酶有很好的耐受性。2.將重組脂肪酶和內(nèi)源性豬肉脂肪酶分別作用于豬肉中,測(cè)定脂肪水解氧化指標(biāo),結(jié)果顯示:經(jīng)脂肪酶處理后的過氧化值、硫代巴比妥酸值(TBA)、羰基價(jià)、雙烯值均高于空白對(duì)照組,表明重組酶具備同內(nèi)源性脂肪酶相似的作用,對(duì)脂肪水解氧化有正向的影響。電子鼻結(jié)合GC-MS檢測(cè)豬肉風(fēng)味,共檢測(cè)出36種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),主要為烴類、雜環(huán)和芳香族化合物、有機(jī)酸和酯類、醛類、酮類、醇類等,其中經(jīng)重組酶與內(nèi)源酶處理后的豬肉醛類風(fēng)味成分相對(duì)含量增加,且重組酶的效果優(yōu)于內(nèi)源酶,進(jìn)一步表明重組酶能促進(jìn)豬肉風(fēng)味物質(zhì)增加,增強(qiáng)豬肉風(fēng)味。3.電子鼻檢測(cè)添加內(nèi)源酶與重組酶后奶制品風(fēng)味有明顯改變。GC-MS檢測(cè)奶制品樣品中揮發(fā)性成分主要為有機(jī)酸和酯類、烴類、醛酮類及雜環(huán)和芳香族類物質(zhì)等,奶制品樣品中呈現(xiàn)奶香味的揮發(fā)性物質(zhì)2-十一酮、2-庚酮、2-壬酮等相對(duì)含量均明顯提高,表明重組酶能夠酶解乳脂肪產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì),有效改善奶制品的風(fēng)味。4.以淀粉為例,考察重組脂肪酶與內(nèi)源性的脂肪酶對(duì)多糖水解的作用效果。當(dāng)內(nèi)源酶的加酶量為2.0 mL,淀粉濃度為6%,反應(yīng)溫度為50℃,體系pH值為6時(shí),淀粉的水解程度達(dá)到最高,水解出葡萄糖含量為1.01 mg;當(dāng)重組酶的酶添加量為2.0 mL,淀粉濃度為6%,反應(yīng)溫度為55℃,體系pH值為8時(shí),淀粉的水解程度達(dá)到最高,水解出葡萄糖含量為1.32 mg。
【學(xué)位授予單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TS202.3;Q78
【圖文】：

是一種特殊的甘油三酯水解酶，存在于動(dòng)物、植物和霉菌、酵母泛應(yīng)用于糧油生產(chǎn)、食品工業(yè)、日用化學(xué)工業(yè)、油脂化學(xué)工業(yè)等酶之后，銷量第三位的食品酶制劑。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的難以提取或者提取成本較高的蛋白，通過基因工程表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)品，從而滿足人們的需求。鑒于本課題前期驗(yàn)證內(nèi)源性的豬肉脂[30][60]的風(fēng)味有積極作用，且有文獻(xiàn)[16]表明脂蛋白脂肪酶（LPL）重要候選基因。為此，為進(jìn)一步驗(yàn)證豬肉脂肪酶對(duì)食品風(fēng)味的影克隆 LPL 基因，并構(gòu)建表達(dá)載體 pET30a-LPL。方法料自遼寧錦州新瑪特超市。菌種30a、感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌 BL21(DE3)錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)

圖 2-1 豬 LPL 基因 RT-P-1 Results of LPL gene RT注：M: DL2000 DNA Marker 1 :LPL 鑒定結(jié)果酶切鑒定結(jié)果重組質(zhì)粒 PCR 鑒定與位置的條帶，即在 102000b10001 1756bp

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2730649