【摘要】：電化學(xué)發(fā)光(ECL)是一種由電化學(xué)反應(yīng)所引起的高能電子轉(zhuǎn)移的化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象。ECL將電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩種檢測技術(shù)相結(jié)合,具有線性范圍寬、背景信號低、可控性高和選擇性好等特點(diǎn)。在分析化學(xué)研究領(lǐng)域中,ECL已成為一種強(qiáng)有力的檢測手段。使用ECL技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞分析或細(xì)胞成像時,由于細(xì)胞在常規(guī)電極上存在空間位阻,使得細(xì)胞覆蓋區(qū)域的ECL反應(yīng)很難發(fā)生或不能充分進(jìn)行,這限制了ECL技術(shù)在細(xì)胞分析中的應(yīng)用。為此,本文借助于通透性基底建立了無細(xì)胞空間位阻的ECL分析方法,并應(yīng)用到ECL細(xì)胞傳感和單細(xì)胞ECL成像分析。主要內(nèi)容如下:1.殼聚糖膜修飾電極上單細(xì)胞直接ECL成像單細(xì)胞成像技術(shù)能夠在單細(xì)胞水平上準(zhǔn)確地反映出細(xì)胞之間的異質(zhì)性,該技術(shù)在闡明細(xì)胞的相關(guān)功能及生物學(xué)機(jī)制時起到至關(guān)重要的作用。電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯微成像技術(shù)憑借其高通量和零細(xì)胞背景光的特點(diǎn),一直被認(rèn)為是一種非常有用的細(xì)胞研究工具。然而,由于細(xì)胞固定在電極表面之后,電極上細(xì)胞的空間位阻和細(xì)胞膜的高度絕緣性使得細(xì)胞的ECL成像很難實現(xiàn)。為了解決這個問題,我們制備了殼聚糖膜和納米二氧化鈦修飾的FTO電極(FTO/TiO2/CS),并在該電極上成功實現(xiàn)了單細(xì)胞的直接ECL成像。具有通透性的殼聚糖膜不僅有利于活細(xì)胞的貼壁,還增加了細(xì)胞底部和電極之間的距離。殼聚糖膜抬升了細(xì)胞之后,使得更多的ECL試劑進(jìn)入細(xì)胞下方,從而提高了定量分析的靈敏度。電極上納米二氧化鈦的修飾,可以增強(qiáng)電極在魯米諾溶液中可視化的ECL信號,提高細(xì)胞成像時的信噪比�；贔TO/TiO2/CS電極,建立了ECL光強(qiáng)和過氧化氫濃度的關(guān)系,并在單細(xì)胞水平上分析了藥物刺激下的過氧化氫釋放情況。據(jù)我們所知,我們的工作首次實現(xiàn)了沒有細(xì)胞空間位阻的單細(xì)胞ECL成像。并且為傳統(tǒng)的電極修飾技術(shù)應(yīng)用到電化學(xué)發(fā)光可視化分析,尤其是細(xì)胞ECL成像分析提供了新思路。2.基于石墨烯水凝膠的ECL傳感器對骨骼肌細(xì)胞表面GLUT4表達(dá)水平分析細(xì)胞表面受體的原位檢測是近年來研究的熱點(diǎn)。本文提出了一種靈敏檢測人骨骼肌細(xì)胞(HSMC)表面葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4(GLUT4)表達(dá)的電化學(xué)發(fā)光方法。石墨烯水凝膠(GH)作為可滲透電極,能夠克服細(xì)胞-電極間空間位阻,增加了細(xì)胞表面受體分析的準(zhǔn)確性。將碳點(diǎn)(CDs)標(biāo)記到細(xì)胞上后,可以在GH與細(xì)胞界面(細(xì)胞下表面)產(chǎn)生ECL發(fā)射,細(xì)胞表面大約一半的GLUT4可以得到檢測。所制備的GH細(xì)胞傳感器對HSMC細(xì)胞表現(xiàn)出良好的分析能力,可以檢測出500～1.0 × 106 cells·mL-1濃度范圍內(nèi)的HSMC細(xì)胞,檢出限可達(dá)200 cells·mL-1。通過計算,平均每個HSMC細(xì)胞表面表達(dá)1.88 × 105個GLUT4分子。此外,在胰島素的作用下,HSMC表面的GLUT4表達(dá)水平提高了2.3倍。該策略可對細(xì)胞表面的受體進(jìn)行合理評估,從而推動ECL在疾病診斷中的應(yīng)用。3.電位分辨ECL同時評估兩種細(xì)胞表面受體及單個凋亡細(xì)胞的可視化診斷單細(xì)胞分析有助于我們深入理解細(xì)胞行為和細(xì)胞間通信,能夠為現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)藥學(xué)的研究提供許多細(xì)節(jié)信息。本實驗開發(fā)了一種電位分辨電化學(xué)發(fā)光(ECL)方法,并將其用于凋亡細(xì)胞的診斷。白藜蘆醇(RVL)處理MCF-7細(xì)胞之后,細(xì)胞表面表皮生長因子受體(EGFR)表達(dá)水平降低。同時,RVL可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸(PS)外翻,細(xì)胞表面PS表達(dá)增多。本實驗以Au@L012和g-C3N4作為ECL探針,并分別用表皮生長因子(EGF)和肽段(PSBP)進(jìn)行功能化,之后與細(xì)胞表面的EGFR和PS進(jìn)行識別結(jié)合。兩種ECL探針在同一電位掃描過程中呈現(xiàn)出兩個峰電位充分分離的ECL信號。Au@L012和g-C3N4的ECL變化反映著細(xì)胞凋亡程度,這為研究細(xì)胞凋亡提供了新的途徑。重要的是,該方法可以同時評估細(xì)胞表面EGFR和PS的表達(dá)水平,并可以在ECL顯微鏡下實現(xiàn)單個凋亡細(xì)胞的可視化診斷。該策略有助于腫瘤標(biāo)志物的可視化研究,推動ECL成像技術(shù)在單細(xì)胞水平上診斷疾病的應(yīng)用。
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q2-33;O657.1
【圖文】：

Ｆｉｇ．邋１－４邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＳＷＣＮＴ－ｂａｓｅｄ邋ＥＣＬ邋ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒｓ逡逑燦等＿就利用ＣＱＤｓ設(shè)計了針對癌胚抗原（ＣＥＡ）免疫檢測的ＥＣＬ傳感器。逡逑如圖１－５，他們將四環(huán)素酸（ＰＴＣＡ）以非共價的方式修飾到石墨烯上，然后與ＣＱＤｓ逡逑和邋ＡｕＮＰｓ復(fù)合，形成ｇｒａｐｌｉｅｎｅ－ＰＴＣＡ－Ｃｕ２—－ＣＱＤｓ／ＡｕＮＰｓ納米復(fù)合物。ＰＴＣＡ和逡逑ＣＱＤｓ在共反應(yīng)劑Ｓ２0８２－中起協(xié)同作用，提高ＥＣＬ強(qiáng)度。ＡｕＮＰｓ連接二抗Ａｂ２后，逡逑可以被捕獲到己經(jīng)負(fù)載一抗ＡｂｊＰＣＥＡ的電極上，構(gòu)成針對ＣＥＡ檢測的夾心免疫逡逑傳感器。此傳感器可以對１邋ｘ邋ｌ0＿３￣ｌ邋ｎｇ＇ｍＬ－１的濃度范圍內(nèi)的ＣＥＡ進(jìn)行靈敏檢測，逡逑檢出限可達(dá)２．６ｘｉ0４邋ｆｇｍＬ－ｉ。在對各種癌癥樣品檢測實驗中，體現(xiàn)出較好的特逡逑異性識別能力。逡逑疆＿美媝逡逑Ｇｒａｐｈｅｎｅ逡逑ｅｔ逡逑ｔ邐ｔ邐ＨＡｕＣｌｆ逡逑圖１－５邋ＥＣＬ免疫傳感器的構(gòu)建及ＣＥＡ的檢測原理Ａ逡逑Ｆｉｇ．邋１－５邋Ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｏｆ邋ＥＣＬ邋ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ邋ａｎｄ邋ＥＣＬ邋ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ．逡逑７逡逑

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本文編號：2727566