【摘要】：p53基因作為腫瘤抑制的關(guān)鍵基因,主要功能是修復(fù)與細(xì)胞周期G、S期有關(guān)的DNA損傷,并且在DNA損傷嚴(yán)重時(shí)誘導(dǎo)受損細(xì)胞的凋亡。因此,p53基因在維持基因組的穩(wěn)定與預(yù)防癌癥發(fā)生方面具有重要的作用。在等摩爾比例下,具有正確DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的野生型p53蛋白比突變型p53蛋白活性更強(qiáng),野生型p53蛋白不僅可以抑制突變型p53蛋白的獲得性功能,而且可以誘導(dǎo)由突變型p53蛋白引起的腫瘤細(xì)胞的凋亡。由于在所有惡性腫瘤中,該基因的突變率在50%以上。因此,p53基因及其表達(dá)產(chǎn)物可以起到預(yù)防腫瘤細(xì)胞發(fā)生和發(fā)展的重要作用。本研究設(shè)計(jì)并構(gòu)建了兩種慢病毒表達(dá)載體pWPI-p53WT-Neo和pWPI-PTEN-Neo,并將上述兩種慢病毒載體和包裝質(zhì)粒(packaging plasmids)組成的包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,收集慢病毒顆粒并測(cè)定pWPI-p53慢病毒和pWPI-PTEN慢病毒的滴度。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程將兩種病毒感染靶細(xì)胞CF-1,利用G418篩選出穩(wěn)定細(xì)胞系后收集細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)樣品。然后,通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)對(duì)收集到的CF-1-p53細(xì)胞和CF-1-p53-PTEN細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明慢病毒介導(dǎo)的人p53基因在CF-1細(xì)胞系中能夠過(guò)表達(dá)p53蛋白,并且慢病毒介導(dǎo)的人p53基因和PTEN基因共同導(dǎo)入CF-1細(xì)胞系中也能過(guò)量表達(dá)p53蛋白,但是與慢病毒介導(dǎo)人p53基因的單獨(dú)導(dǎo)入CF-1細(xì)胞相比產(chǎn)生的p53蛋白較少。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明本研究成功建立了人p53基因穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。本研究還通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)p53基因和PTEN基因表達(dá)后對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢病毒介導(dǎo)的人p53基因的導(dǎo)入會(huì)對(duì)CF-1細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用,而慢病毒介導(dǎo)的人p53基因和慢病毒介導(dǎo)的PTEN基因的同時(shí)導(dǎo)入同樣會(huì)對(duì)CF-1細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用,并且抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的程度比慢病毒介導(dǎo)的人p53基因單獨(dú)導(dǎo)入的細(xì)胞更加強(qiáng)烈。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CF-1-p53-PTEN細(xì)胞系較CF-1-p53細(xì)胞系中p53蛋白的過(guò)表達(dá)量少,可能是因?yàn)镻TEN基因與p53基因的同時(shí)過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用引起的。綜上所述,本論文成功構(gòu)建了慢病毒表達(dá)載體pWPI-p53WT-Neo和pWPI-PTEN-Neo,并利用G418篩選出pWPI-p53慢病毒和pWPI-PTEN慢病毒感染的穩(wěn)定細(xì)胞系CF-1-p53和CF-1-p53-PTEN。通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)成功檢測(cè)到兩種細(xì)胞內(nèi)p53蛋白的過(guò)量表達(dá),并且利用細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定證明p53和PTEN基因的過(guò)量表達(dá)對(duì)CF-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。本論文為利用p53基因治療癌癥提供了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q78
【圖文】：

得分別含有 p53 基因和 PTEN 基因的目的基因片段。PIRES-EGFP-p53WT 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖 2-1所示。圖2-1 PIRES-EGFP-p53WT質(zhì)粒圖譜Figure 2-1 PIRES-EGFP-p53WT plasmid map

山東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文15圖2-2 pWPI-hPLK2WT-Neo載體圖譜Figure 2-2 pWPI-hPLK2WT-Neo vector map表2-3 pWPI-hPLK2WT-Neo質(zhì)粒酶切反應(yīng)體系Table 2-3 pWPI-hPLK2WT-Neo plasmid digestion reaction systempWPI-hPLK2WT-NeoEB buffer 0 μL10×3.1 buffer 20 μLplasmid 175 μLBam HI 5 μLTotal 200 μLpWPI-hPLK2WT-Neo 質(zhì)粒酶切反應(yīng)條件為：37℃反應(yīng) 2 h，65℃反應(yīng) 20 min。1.0％瓊脂糖電泳后，回收酶切片段。

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本文編號(hào)：2718465