【摘要】：耐輻射奇球菌(Deinococcus radiodurans,DR)是一種具有極端抗性的微生物,對(duì)電離輻射(Ionizing radiation,IR)、紫外輻射、干旱、氧化脅迫和誘變劑等損傷因子均表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗性,常作為研究DNA損傷修復(fù)的模式生物。耐輻射奇球菌的DNA損傷修復(fù)能力極強(qiáng),這依賴于其高效的損傷修復(fù)途徑。PprI蛋白被稱為耐輻射奇球菌的輻射損傷響應(yīng)開關(guān),PprI-DdrO介導(dǎo)的DNA損傷響應(yīng)途徑與大腸桿菌中經(jīng)典SOS響應(yīng)機(jī)制有較大的差異,屬于一種新型的損傷修復(fù)途徑。而PprI作為這條途徑的主角,發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。PprI同源物IrrE的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析,其中位于C端的GAF結(jié)構(gòu)域功能尚未知曉。近年來的研究表明,GAF結(jié)構(gòu)域主要在細(xì)胞內(nèi)行使著信號(hào)分子受體的作用,說明其可能在PprI-DdrO介導(dǎo)的DNA損傷響應(yīng)途徑中發(fā)揮作用。以探究PprI的GAF結(jié)構(gòu)域的功能為目的,開展了一系列研究,具體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:通過蛋白序列比對(duì),揭示了 GAF結(jié)構(gòu)域序列在同類菌株中具有同源性,通過解析PprI晶體結(jié)構(gòu)并進(jìn)行比對(duì),進(jìn)一步說明了 GAF結(jié)構(gòu)域極為保守,研究這一結(jié)構(gòu)域在奇球菌屬中具有普適性;PprI是耐輻射奇球菌中響應(yīng)損傷的關(guān)鍵蛋白,其主要包括:N端類鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域、HTH結(jié)構(gòu)域以及GAF結(jié)構(gòu)域。敲除GAF結(jié)構(gòu)域后,耐輻射奇球菌對(duì)UV和γ損傷的耐受性與野生型相比下降了兩個(gè)數(shù)量級(jí),幾乎與PprI敲除株類似,表明GAF結(jié)構(gòu)域?qū)prI完整功能至關(guān)重要;PprI可以通過切割轉(zhuǎn)錄抑制子DdrO,啟動(dòng)下游修復(fù)基因的表達(dá)。構(gòu)建截短GAF結(jié)構(gòu)域的PprI蛋白,以及GAF結(jié)構(gòu)域蛋白,發(fā)現(xiàn)GAF結(jié)構(gòu)域被截短后基本不會(huì)影響PprI蛋白的酶切活性;通過酵母雙雜交檢測(cè)GAF結(jié)構(gòu)域在PprI與RNA聚合酶β亞基互作中的作用,發(fā)現(xiàn)截去GAF結(jié)構(gòu)域影響PpIT176A與RNA聚合酶的互作能力,說明GAF結(jié)構(gòu)域可能在RNA聚合酶β亞基的招募中發(fā)揮作用;比對(duì) Deinococcus radiodurans 和 Deinnococcus deserti的 GAF 結(jié)構(gòu)域,發(fā)現(xiàn)兩者的GAF結(jié)構(gòu)域都形成了一個(gè)類似空腔的結(jié)構(gòu),推測(cè)其可能會(huì)用于結(jié)合小分子信號(hào)物質(zhì),從而行使接受信號(hào)的功能;采用等溫滴定量熱法測(cè)定小分子cGMP、cAMP與GAF結(jié)構(gòu)域的結(jié)合能力,結(jié)果表明,GAF結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合cGMP,不能結(jié)合cAMP;本研究通過一系列生理生化試驗(yàn),初步探索了 PprI蛋白的GAF結(jié)構(gòu)域在耐輻射奇球菌中的功能,證實(shí)GAF結(jié)構(gòu)域通過影響RNA聚合酶的招募在耐輻射奇球菌紫外以及γ損傷抗性中發(fā)揮著重要作用,推測(cè)其可能是通過結(jié)合信號(hào)小分子cGMP來響應(yīng)上游損傷。通過對(duì)該結(jié)構(gòu)域的功能研究,為PprI-DdrO介導(dǎo)的DNA損傷響應(yīng)途徑上游響應(yīng)機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q933
【圖文】：

耐輻射奇球菌細(xì)胞外被與革蘭氏陰性菌雙層細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)類似，但其肽聚糖逡逑層較厚，導(dǎo)致脫色較為困難，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，因此被認(rèn)為是一種革蘭氏陽(yáng)性逡逑菌。耐輻射奇球菌的細(xì)胞壁在電鏡下可以分為六層（圖１．２）邋［３，４］，細(xì)胞膜在最逡逑內(nèi)層，其次是含有肽聚糖并且多孔的細(xì)胞壁，第三層是分區(qū)層，緊挨著分區(qū)層的逡逑是外膜，第五層是電子比較密集的區(qū)域；最外層由六角形蛋白分子單體（由ＳｌｐＡ、逡逑Ｈｐｉ等蛋白組成）規(guī)則排列而成，常被稱為Ｓ層，這層結(jié)構(gòu)極大地提高了細(xì)胞的逡逑剛性，在細(xì)胞膜與外界配體的結(jié)合中也發(fā)揮著重要作用；也有一些耐輻射奇球菌逡逑外層還有一層較厚的多糖外被［３，邋４］。逡逑—：！逡逑Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ邋ｌａｙｅｒ邋．邐ＳＩｐＡ邐｜逡逑Ｐｅｐｔｉｄｏｇｉｙｃａｎ邋■逡逑圖１．２耐輻射奇球菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)圖［４］逡逑Ｆｉｇｌ．２邋Ｃｅｌｌ邋ｗａｌｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ａｃｔｉｎｏｃｏｃｃｕｓ邋ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ逡逑１．１．２耐輻射奇球菌基因組信息逡逑１９９９年Ｗｈｉｔｅ邋０等采用“隨機(jī)全基因組鳥槍法”對(duì)耐輻射奇球菌Ｒ１的基因俎逡逑進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，Ｒ１基因組總體大小為３．２８Ｍｂ［５］，由４個(gè)環(huán)狀染色體組成，逡逑如圖１．３，根據(jù)ＤＮＡ分子由大到小的順序分別命名為：Ｉ號(hào)染色體（２，６４８，６３８ｂｐ）、逡逑ＩＩ號(hào)染色體（４１２

邐■■■0？？？逡逑；＾ｒ－邐４，２３４８邋０ｐ邋；逡逑圖１．３耐輻射奇球菌基因組ＤＮＡ分子組成ｐ］逡逑Ｆｉｇｌ邋．３邋Ｇｅｎｏｍｅ邋ｏｆ邋Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ邋ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ逡逑１．２耐輻射奇球菌的輻射損傷抗性逡逑耐輻射奇球菌比較顯著的一個(gè)功能特征就是輻射耐受性強(qiáng)，在Ｙ輻照下，８逡逑Ｇｙ／ｈ的劑量基本不影響其生長(zhǎng)（圖１．４Ａ圖所示），在６０Ｇｙ／ｈ的輻射下仍＇可以逡逑緩慢生長(zhǎng)，甚至可以在１５ＫＧｙ的電離輻射中存活，其輻射抗性是大腸桿菌的一逡逑千倍以上。除此之外，在干q�、Ｕ�(zhí)硪約八苛衙顧卮淼燃頌跫攏頭義仙淦媲蚓哪褪芐躍蠓雀哂詿蟪Ω司ㄍ跡保粗校�、Ｖ櫌Ｄ图所是G�。辶x希鈴危殄危洛義希苠澹咤澹咤澹幔潁錚洌簦錚洌酰媯幔睿椋蓿蓿掊危埃�、＇＇ｙ逦Ｄ．}幔簦齲錚洌酰簦錚錚翦義��！卞澹苠危苠危茫希灣澹苠義稀福苠危苠澹欏＃海誨危苠義

本文編號(hào)：2718193