【摘要】：耐輻射奇球菌(Deinococcus radiodurans,DR)是一種具有極端抗性的微生物,對電離輻射(Ionizing radiation,IR)、紫外輻射、干旱、氧化脅迫和誘變劑等損傷因子均表現出極強的抗性,常作為研究DNA損傷修復的模式生物。耐輻射奇球菌的DNA損傷修復能力極強,這依賴于其高效的損傷修復途徑。PprI蛋白被稱為耐輻射奇球菌的輻射損傷響應開關,PprI-DdrO介導的DNA損傷響應途徑與大腸桿菌中經典SOS響應機制有較大的差異,屬于一種新型的損傷修復途徑。而PprI作為這條途徑的主角,發(fā)揮著至關重要的作用。PprI同源物IrrE的晶體結構已經解析,其中位于C端的GAF結構域功能尚未知曉。近年來的研究表明,GAF結構域主要在細胞內行使著信號分子受體的作用,說明其可能在PprI-DdrO介導的DNA損傷響應途徑中發(fā)揮作用。以探究PprI的GAF結構域的功能為目的,開展了一系列研究,具體的實驗結果如下:通過蛋白序列比對,揭示了 GAF結構域序列在同類菌株中具有同源性,通過解析PprI晶體結構并進行比對,進一步說明了 GAF結構域極為保守,研究這一結構域在奇球菌屬中具有普適性;PprI是耐輻射奇球菌中響應損傷的關鍵蛋白,其主要包括:N端類鋅指蛋白結構域、HTH結構域以及GAF結構域。敲除GAF結構域后,耐輻射奇球菌對UV和γ損傷的耐受性與野生型相比下降了兩個數量級,幾乎與PprI敲除株類似,表明GAF結構域對PprI完整功能至關重要;PprI可以通過切割轉錄抑制子DdrO,啟動下游修復基因的表達。構建截短GAF結構域的PprI蛋白,以及GAF結構域蛋白,發(fā)現GAF結構域被截短后基本不會影響PprI蛋白的酶切活性;通過酵母雙雜交檢測GAF結構域在PprI與RNA聚合酶β亞基互作中的作用,發(fā)現截去GAF結構域影響PpIT176A與RNA聚合酶的互作能力,說明GAF結構域可能在RNA聚合酶β亞基的招募中發(fā)揮作用;比對 Deinococcus radiodurans 和 Deinnococcus deserti的 GAF 結構域,發(fā)現兩者的GAF結構域都形成了一個類似空腔的結構,推測其可能會用于結合小分子信號物質,從而行使接受信號的功能;采用等溫滴定量熱法測定小分子cGMP、cAMP與GAF結構域的結合能力,結果表明,GAF結構域可以結合cGMP,不能結合cAMP;本研究通過一系列生理生化試驗,初步探索了 PprI蛋白的GAF結構域在耐輻射奇球菌中的功能,證實GAF結構域通過影響RNA聚合酶的招募在耐輻射奇球菌紫外以及γ損傷抗性中發(fā)揮著重要作用,推測其可能是通過結合信號小分子cGMP來響應上游損傷。通過對該結構域的功能研究,為PprI-DdrO介導的DNA損傷響應途徑上游響應機制研究奠定了基礎。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q933
【圖文】：

耐輻射奇球菌細胞外被與革蘭氏陰性菌雙層細胞膜的結構類似，但其肽聚糖逡逑層較厚，導致脫色較為困難，革蘭氏染色呈陽性，因此被認為是一種革蘭氏陽性逡逑菌。耐輻射奇球菌的細胞壁在電鏡下可以分為六層（圖１．２）邋［３，４］，細胞膜在最逡逑內層，其次是含有肽聚糖并且多孔的細胞壁，第三層是分區(qū)層，緊挨著分區(qū)層的逡逑是外膜，第五層是電子比較密集的區(qū)域；最外層由六角形蛋白分子單體（由ＳｌｐＡ、逡逑Ｈｐｉ等蛋白組成）規(guī)則排列而成，常被稱為Ｓ層，這層結構極大地提高了細胞的逡逑剛性，在細胞膜與外界配體的結合中也發(fā)揮著重要作用；也有一些耐輻射奇球菌逡逑外層還有一層較厚的多糖外被［３，邋４］。逡逑—：！逡逑Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ邋ｌａｙｅｒ邋．邐ＳＩｐＡ邐｜逡逑Ｐｅｐｔｉｄｏｇｉｙｃａｎ邋■逡逑圖１．２耐輻射奇球菌細胞壁結構圖［４］逡逑Ｆｉｇｌ．２邋Ｃｅｌｌ邋ｗａｌｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ａｃｔｉｎｏｃｏｃｃｕｓ邋ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ逡逑１．１．２耐輻射奇球菌基因組信息逡逑１９９９年Ｗｈｉｔｅ邋０等采用“隨機全基因組鳥槍法”對耐輻射奇球菌Ｒ１的基因俎逡逑進行測序，結果表明，Ｒ１基因組總體大小為３．２８Ｍｂ［５］，由４個環(huán)狀染色體組成，逡逑如圖１．３，根據ＤＮＡ分子由大到小的順序分別命名為：Ｉ號染色體（２，６４８，６３８ｂｐ）、逡逑ＩＩ號染色體（４１２

邐■■■0？？？逡逑；＾ｒ－邐４，２３４８邋０ｐ邋；逡逑圖１．３耐輻射奇球菌基因組ＤＮＡ分子組成ｐ］逡逑Ｆｉｇｌ邋．３邋Ｇｅｎｏｍｅ邋ｏｆ邋Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ邋ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ逡逑１．２耐輻射奇球菌的輻射損傷抗性逡逑耐輻射奇球菌比較顯著的一個功能特征就是輻射耐受性強，在Ｙ輻照下，８逡逑Ｇｙ／ｈ的劑量基本不影響其生長（圖１．４Ａ圖所示），在６０Ｇｙ／ｈ的輻射下仍＇可以逡逑緩慢生長，甚至可以在１５ＫＧｙ的電離輻射中存活，其輻射抗性是大腸桿菌的一逡逑千倍以上。除此之外，在干q�、Ｕ�(zhí)硪約八苛衙顧卮淼燃頌跫攏頭義仙淦媲蚓哪褪芐躍蠓雀哂詿蟪Ω司ㄍ跡保粗校�、Ｖ櫌Ｄ图所是G�。辶x希鈴危殄危洛義希苠澹咤澹咤澹幔潁錚洌簦錚洌酰媯幔睿椋蓿蓿掊危埃�、＇＇ｙ逦Ｄ．}幔簦齲錚洌酰簦錚錚翦義��！卞澹苠危苠危茫希灣澹苠義稀福苠危苠澹欏＃海誨危苠義

本文編號：2718193