【摘要】：解脂亞羅酵母是生物合成β-胡蘿卜素的理想菌株,目前本課題組已經(jīng)利用解脂亞羅酵母成功構建了具有β-胡蘿卜素合成能力的重組菌株,但還存在以下問題尚未解決,首先該重組菌株中所有基因均為游離表達,質粒和菌體不會同時進行復制,菌株的穩(wěn)定性較差且β-胡蘿卜素含量較低;其次用于解脂亞羅酵母中的基因工程技術效率較低。因此,本研究擬以解脂亞羅酵母作為底盤細胞工廠構建產(chǎn)β-胡蘿卜素的穩(wěn)定菌株,在此基礎上通過調控代謝平衡提高β-胡蘿卜素的含量,并在解脂亞羅酵母中對Crispr-cas9技術進行初步探索。主要研究內容和結果如下:(1)產(chǎn)β-胡蘿卜素穩(wěn)定菌株YL-C1的初步構建。通過在polf和產(chǎn)油菌株polf-mfe--pex10-中合成β-胡蘿卜素篩選出最優(yōu)宿主菌為polf,在中敲除Ku70基因提高同源重組的效率,在此基礎上以Snf為靶點將基因Thmg,Ggs1,CarRA,CarB整合至敲除ku70基因的Y.lipolytica polf基因組中,構建了產(chǎn)β-胡蘿卜素的穩(wěn)定重組菌株,經(jīng)過60代的傳代重組菌株的穩(wěn)定性下降緩慢,β-胡蘿卜素的含量達到了2.34mg/g DCW。(2)調控關鍵基因Thmg、Ggs1的拷貝數(shù)提高β-胡蘿卜素的含量。對Y.lipolytica polf(Δku70)中β-胡蘿卜素代謝通路的中間產(chǎn)物HMG-CoA,FPP測定后發(fā)現(xiàn),當菌體中含有2Thmg時,β-胡蘿卜素的含量達到最高,為14.12 mg/g DCW,當菌株中含有1Ggs1時,β胡蘿卜素的含量最高,為11.86mg/g DCW。(3)解脂亞羅酵母中Crispr-cas9體系的構建。通過對影響Crispr-cas9技術關鍵因素的研究發(fā)現(xiàn)敲除基因Ku70使同源重組的效率提高25%;最佳Donor DNA長度為100bp;Donor DNA濃度越高越好:打靶位點的評分系統(tǒng)中特異性分在100左右、推薦細胞中表達的指導分數(shù)在60左右,推薦用于體外轉錄的指導分數(shù)在40左右,框架內缺失的克隆百分比分數(shù)在40左右,脫靶效率為0時效果最佳。本研究構建了產(chǎn)β-胡蘿卜素的穩(wěn)定重組菌株YL-C1,對生物合成類胡蘿卜素具有一定的指導意義;同時對解脂亞羅酵母中Crispr-cas9技術進行了初步探索,這為在解脂亞羅酵母中利用Crispr-cas9技術奠定了基礎。
【學位授予單位】：陜西師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q93
【圖文】：

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本文編號：2718167