發(fā)布時(shí)間：2020-06-17 21:09

【摘要】：解脂亞羅酵母是生物合成β-胡蘿卜素的理想菌株,目前本課題組已經(jīng)利用解脂亞羅酵母成功構(gòu)建了具有β-胡蘿卜素合成能力的重組菌株,但還存在以下問(wèn)題尚未解決,首先該重組菌株中所有基因均為游離表達(dá),質(zhì)粒和菌體不會(huì)同時(shí)進(jìn)行復(fù)制,菌株的穩(wěn)定性較差且β-胡蘿卜素含量較低;其次用于解脂亞羅酵母中的基因工程技術(shù)效率較低。因此,本研究擬以解脂亞羅酵母作為底盤(pán)細(xì)胞工廠構(gòu)建產(chǎn)β-胡蘿卜素的穩(wěn)定菌株,在此基礎(chǔ)上通過(guò)調(diào)控代謝平衡提高β-胡蘿卜素的含量,并在解脂亞羅酵母中對(duì)Crispr-cas9技術(shù)進(jìn)行初步探索。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:(1)產(chǎn)β-胡蘿卜素穩(wěn)定菌株YL-C1的初步構(gòu)建。通過(guò)在polf和產(chǎn)油菌株polf-mfe--pex10-中合成β-胡蘿卜素篩選出最優(yōu)宿主菌為polf,在中敲除Ku70基因提高同源重組的效率,在此基礎(chǔ)上以Snf為靶點(diǎn)將基因Thmg,Ggs1,CarRA,CarB整合至敲除ku70基因的Y.lipolytica polf基因組中,構(gòu)建了產(chǎn)β-胡蘿卜素的穩(wěn)定重組菌株,經(jīng)過(guò)60代的傳代重組菌株的穩(wěn)定性下降緩慢,β-胡蘿卜素的含量達(dá)到了2.34mg/g DCW。(2)調(diào)控關(guān)鍵基因Thmg、Ggs1的拷貝數(shù)提高β-胡蘿卜素的含量。對(duì)Y.lipolytica polf(Δku70)中β-胡蘿卜素代謝通路的中間產(chǎn)物HMG-CoA,FPP測(cè)定后發(fā)現(xiàn),當(dāng)菌體中含有2Thmg時(shí),β-胡蘿卜素的含量達(dá)到最高,為14.12 mg/g DCW,當(dāng)菌株中含有1Ggs1時(shí),β胡蘿卜素的含量最高,為11.86mg/g DCW。(3)解脂亞羅酵母中Crispr-cas9體系的構(gòu)建。通過(guò)對(duì)影響Crispr-cas9技術(shù)關(guān)鍵因素的研究發(fā)現(xiàn)敲除基因Ku70使同源重組的效率提高25%;最佳Donor DNA長(zhǎng)度為100bp;Donor DNA濃度越高越好:打靶位點(diǎn)的評(píng)分系統(tǒng)中特異性分在100左右、推薦細(xì)胞中表達(dá)的指導(dǎo)分?jǐn)?shù)在60左右,推薦用于體外轉(zhuǎn)錄的指導(dǎo)分?jǐn)?shù)在40左右,框架內(nèi)缺失的克隆百分比分?jǐn)?shù)在40左右,脫靶效率為0時(shí)效果最佳。本研究構(gòu)建了產(chǎn)β-胡蘿卜素的穩(wěn)定重組菌株YL-C1,對(duì)生物合成類胡蘿卜素具有一定的指導(dǎo)意義;同時(shí)對(duì)解脂亞羅酵母中Crispr-cas9技術(shù)進(jìn)行了初步探索,這為在解脂亞羅酵母中利用Crispr-cas9技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：陜西師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q93
【圖文】：

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【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

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相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

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本文編號(hào)：2718167