【摘要】：黑曲霉作為一種重要的工業(yè)生產(chǎn)菌株,已逐步開發(fā)成為一種重要的酶表達系統(tǒng)。在本研究中,首先選擇一株低蛋白背景且潮霉素敏感菌株為表達宿主,并對農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法和PEG-原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法進行條件優(yōu)化,然后以脂肪酶為模式酶在黑曲霉中進行同源/異源脂肪酶的表達。通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平改造提高了黑曲霉脂肪酶ANL的表達量,并進行了酶學(xué)性質(zhì)研究。最后初步開展了CRISPR/cas9技術(shù)在黑曲霉表達系統(tǒng)中的應(yīng)用,構(gòu)建了尿嘧啶缺陷型菌株。主要結(jié)果如下:(1)對農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化和PEG-原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化兩種方法進行了條件優(yōu)化。優(yōu)化后農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的條件是不萌發(fā)的新鮮孢子與OD_(600)培養(yǎng)至0.9-1.0的農(nóng)桿菌以1:1的比例混合后,在乙酰丁香酮濃度為200μmol·L~(-1)的IM平板上,23 ~oC避光培養(yǎng)48 h后進行轉(zhuǎn)膜。最佳轉(zhuǎn)化效率大約為每10~6個孢子獲得60±5個轉(zhuǎn)化子,并且陽性率保持在90%以上。原生質(zhì)體制備條件為:10~7個?mL~(-1)黑曲霉孢子接種PDA浸提液,30 ~oC,200 r·min~(-1)培養(yǎng)24 h,收集菌絲體,按質(zhì)量體積比1:10加入裂解酶液(0.8 mol·L~(-1) MgSO_4,1%纖維素酶,0.5%蝸牛酶,0.25%溶菌酶),37 ~oC,120 r·min~(-1)酶解2.5 h后收集原生質(zhì)體,獲得原生質(zhì)體個數(shù)約6.8×10~5個?mL~(-1),原生質(zhì)體再生率約63±2.5%。(2)將同源及異源蛋白在黑曲霉中進行表達,異源華根霉脂肪酶RCL在黑曲霉CICC2169中未能表達,同源黑曲霉脂肪酶ANL可以表達但表達量較低。啟動子轉(zhuǎn)錄水平分析,誘導(dǎo)型啟動子glaA轉(zhuǎn)錄水平相比于野生型提高50.35倍,而組成型啟動子gpdA轉(zhuǎn)錄水平相比于野生型提高994.86倍。嘗試3種方式來提高ANL的表達水平,包括補充內(nèi)含子(提高mRNA的穩(wěn)定性)、添加kozak序列(增強翻譯效率)、不同信號肽(增強蛋白胞外分泌效率)。在均是glaA為信號肽的前提下,改造之前初始轉(zhuǎn)化子檢測不到酶活力,單補充內(nèi)含子的轉(zhuǎn)化子酶活約為75.80 U?mL~(-1),單添加kozak序列的轉(zhuǎn)化子酶活約為61.33 U?mL~(-1),信號肽的影響效果為cbhⅠsignalANL signalglaA signal。整合三種策略,表達最好的轉(zhuǎn)化子為kocbhS-ANL1000,最高酶活達到314.67 U?mL~(-1)。在含有kozak序列的前提下,具有g(shù)laA、ANL、cbhⅠ信號肽的補充內(nèi)含子轉(zhuǎn)化子比相應(yīng)的不含內(nèi)含子轉(zhuǎn)化子脂肪酶發(fā)酵活力分別提高了1.64倍、1.94倍、3.61倍。酶學(xué)性質(zhì)研究表明ANL最適pH為3.0,最適溫度為45 ~oC。(3)將CRISPR/cas9基因編輯技術(shù)在黑曲霉中應(yīng)用,將CRISPR/cas9質(zhì)粒通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法向黑曲霉轉(zhuǎn)化并篩選轉(zhuǎn)化子。sgRNA靶向pyrG基因,篩選轉(zhuǎn)化子獲得尿嘧啶缺陷型菌株(?pyrG),通過測序確定突變位點,確定是位于sgRNA區(qū)域內(nèi),打靶效率約25%。sgRNA靶向hyg基因,嘗試通過CRISPR靶向hyg基因進行破壞,但是未獲得陽性轉(zhuǎn)化子。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS201.3
【圖文】：

第一章 緒論第一章 緒 論.1 立題依據(jù)黑曲霉(Aspergillus niger，A. niger)是一種常見的工業(yè)酶制劑生產(chǎn)菌株，隨著越來越多的外源基因在黑曲霉中活性表達，黑曲霉逐漸被開發(fā)為微生物細胞工廠，成為一種具有開發(fā)力的酶表達系統(tǒng)。黑曲霉需求的生長能源、溫度和 pH 條件較為寬泛，應(yīng)對外界壓力的抗性強，進行無性生殖產(chǎn)生分生孢子，染色體為單倍體，分生孢子梗會繼續(xù)分化生長，這些生條件為黑曲霉分泌蛋白奠定基礎(chǔ)[1, 2]。

桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化采用的農(nóng)桿菌(Agrobacterium)為根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefacieefaciens)。1998 年，de Groot 等[22]首先將農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化應(yīng)用于泡盛曲霉(Aspergori，A. awarmori)，為絲狀真菌的基因轉(zhuǎn)化提供了新思路。乙酰丁香酮(acetosyringon羥基乙酰丁香酮(hydroxyacetosyringone，OH-AS)可作為誘導(dǎo)劑，在一系列毒力蛋白的實現(xiàn) T-DNA 的斷裂、轉(zhuǎn)移及向宿主的侵染。生型的 Ti 質(zhì)粒存在于天然農(nóng)桿菌中不利于轉(zhuǎn)化應(yīng)用，于是在此基礎(chǔ)上進行改造發(fā)展系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)，在這兩種載體系統(tǒng)中 T-DNA(轉(zhuǎn)移區(qū))和 Vir 區(qū)(毒力區(qū))均是必]。共整合系統(tǒng)是由 Ti 質(zhì)粒和大腸桿菌穿梭質(zhì)粒構(gòu)成，其中 Ti 質(zhì)粒同時含有轉(zhuǎn)移區(qū)，大腸桿菌穿梭質(zhì)粒和 Ti 質(zhì)粒通過同源序列發(fā)生重組交換，因此可以通過改造穿梭改變 T-DNA 序列，重組交換后形成共整合質(zhì)粒，再由含有共整合質(zhì)粒的農(nóng)桿菌對于行侵染。雙元載體也是由兩個質(zhì)粒構(gòu)成，不過轉(zhuǎn)移區(qū)和毒力區(qū)分別位于兩個質(zhì)粒上含有 T-DNA 并且可在大腸桿菌中穿梭的 mini-Ti 載體，另一個是含有 Vir 區(qū)的輔助系列毒力蛋白的刺激活化，使克隆載體上兩個邊界的底部鏈重復(fù)區(qū)(RB/LB)斷開，導(dǎo) 的釋放，并且繼續(xù)在其它毒力蛋白的作用下，將 T-DNA 進行運輸轉(zhuǎn)移，靶向宿主完成基因的插入或是靶向替換[24]。

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 楊雨滋;金寶仲;王國璋;;關(guān)于脂肪酶在制革毛皮上的應(yīng)用[J];皮革科技;1987年02期

2 H.T.Khor;彭先群;;脂肪酶催化水解棕櫚油[J];日用化學(xué)品科學(xué);1988年01期

3 董純定,徐秀蘭,譚成云;藥用胰酶中脂肪酶活力測定[J];中國藥科大學(xué)學(xué)報;1988年01期

4 王美英;徐家立;;白地霉一新變種的鑒定及其脂肪酶的研究[J];微生物學(xué)報;1989年01期

5 高貴,韓四平,王智,翁梁,王柏婧,馮雁,曹淑桂,高淑娟;脂肪酶活力檢測方法的比較[J];藥物生物技術(shù);2002年05期

6 李錦才;鐘響;馬澤雄;;脂肪酶活力檢測方法分析[J];食品安全導(dǎo)刊;2016年06期

7 羅來保;;嗜熱脂肪酶研究進展[J];銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報;2013年05期

8 郇延軍;周光宏;徐幸蓮;趙改名;;金華火腿加工過程中內(nèi)源脂肪酶活力變化特點研究[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2007年08期

9 紀(jì)建業(yè);;脂肪酶活力測定方法的改進[J];通化師范學(xué)院學(xué)報;2005年06期

10 謝清;王瑤;陳尚武;李平蘭;;高產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選鑒定[J];中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2018年05期

相關(guān)會議論文 前3條

1 鄭毅;吳朝娟;吳松剛;;脂肪酶活力檢測方法的研究[A];2004年全國生物技術(shù)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2004年

2 張謙;賈佳;林智;郭宏濤;王劍英;;飼料用脂肪酶產(chǎn)生菌——黑曲霉G55高產(chǎn)菌株的選育[A];中國職協(xié)2016年度優(yōu)秀科研成果獲獎?wù)撐募▽W(xué)校二等獎）[C];2016年

3 林崗;饒小珍;陳寧;郭世群;許友勤;;龜足成體的五種消化酶活力[A];中國甲殼動物學(xué)會第十一屆年會暨學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 周燁;高溫液體脂肪酶的設(shè)計[D];吉林大學(xué);2019年

2 劉武;假單胞菌脂肪酶的表達及調(diào)控機制研究[D];華中科技大學(xué);2019年

3 李娜;兩株脂肪酶產(chǎn)生菌基因組掃描分析與HS-BTLm合成及功能鑒定[D];華中師范大學(xué);2016年

4 楊秀霞;南極細菌Moritella sp.低溫脂肪酶基因的克隆與表達[D];中國海洋大學(xué);2004年

5 馬吉勝;枯草桿菌脂肪酶的基因克隆、定向進化與非水酶學(xué)研究[D];吉林大學(xué);2005年

6 戴大章;立體選擇性脂肪酶在手性化合物拆分中的應(yīng)用基礎(chǔ)研究[D];浙江大學(xué);2006年

7 王海燕;熒光假單孢菌脂肪酶基因的克隆、改造及其在畢赤酵母中的表達[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2006年

8 唐良華;脂肪酶的生產(chǎn)及其在布洛芬手性拆分中的應(yīng)用基礎(chǔ)研究[D];浙江大學(xué);2007年

9 牛衛(wèi)寧;少根根霉脂肪酶基因的表達及定向進化研究[D];北京化工大學(xué);2006年

10 肖彌彰;高產(chǎn)脂肪酶菌種選育與脂肪酶催化合成生物柴油[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 姜占寶;提高脂肪酶熱穩(wěn)定性的理性設(shè)計研究[D];云南師范大學(xué);2019年

2 朱思遠;無抗黑曲霉表達系統(tǒng)構(gòu)建及脂肪酶的表達[D];江南大學(xué);2019年

3 黃麗娟;米曲霉脂肪酶基因在畢赤酵母中的高效表達與應(yīng)用[D];浙江工業(yè)大學(xué);2018年

4 徐潤學(xué);沒食子酸及三種兒茶素酚類對米黑毛霉脂肪酶抑制機理研究[D];廈門大學(xué);2018年

5 徐晶晶;重組粘質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶的制備及其在手性拆分中的應(yīng)用[D];華東理工大學(xué);2019年

6 程琪;基于二甲亞砜激動效應(yīng)的脂肪酶蛋白質(zhì)活性相關(guān)的結(jié)構(gòu)拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)分析[D];上海交通大學(xué);2017年

7 張向領(lǐng);擴展青霉脂肪酶氧陰離子洞結(jié)構(gòu)突變株的表達及性質(zhì)鑒定[D];福建師范大學(xué);2018年

8 高嘉心;來源于類芽孢桿菌屬脂肪酶的克隆表達、酶學(xué)性質(zhì)及其催化合成棕櫚酸乙酯的研究[D];華南理工大學(xué);2018年

9 麻梅梅;裂殖壺菌脂肪酶基因在畢赤酵母中的表達及酶學(xué)性質(zhì)的研究[D];江南大學(xué);2018年

10 張曉鳳;酸性脂肪酶的高效表達、酶學(xué)性質(zhì)及其應(yīng)用研究[D];江南大學(xué);2018年

本文編號：2717925