【摘要】：EF-P(Elongation factor P)是廣泛存在于細菌中的蛋白質(zhì)翻譯延伸因子,其主要功能是減緩由新生肽鏈上的聚脯氨酸序列引起的核糖體翻譯延宕并促進肽鍵的合成。此外,EF-P蛋白的翻譯后修飾對其功能的發(fā)揮起著重要的作用。目前國內(nèi)外鮮見有關(guān)放線菌綱EF-P蛋白的翻譯后修飾方式的研究報道,闡明其翻譯后修飾方式對其生命活動的研究具有重大的生物學意義。本論文選取嗜根考克氏菌DC2201為研究材料,通過大腸桿菌異源表達其EF-P蛋白,并利用重組蛋白EF-P作為免疫抗原制備抗EF-P重組蛋白的單克隆抗體,獲得的單克隆抗體可用于釣取嗜根考克氏菌DC2201天然蛋白EF-P,以期為解析其翻譯后修飾方式奠定實驗基礎(chǔ)。具體內(nèi)容及結(jié)果如下:1嗜根考克氏菌DC2201 EF-P蛋白的生物信息學分析、表達及鑒定首先經(jīng)生物信息學分析,efp基因全長為564 bp,編碼氨基酸187個,蛋白質(zhì)理論分子量為21 kDa左右,為親水性的酸性細胞質(zhì)蛋白。其主要的二級結(jié)構(gòu)是β折疊;通過對其系統(tǒng)進化分析,表征EF-P的保守性較高。其次利用分子生物學的手段成功構(gòu)建了重組克隆載體pMD19-T-efp以及重組表達載體pET-29a(+)-efp,且通過誘導表達、鎳離子親和層析柱純化及SDS-PAGE、MALDI-TOF-TOF鑒定,獲得了大小約為25 kDa的重組蛋白EF-P。2重組蛋白EF-P誘導表達條件的優(yōu)化優(yōu)化表達條件(誘導起始菌體濃度、誘導溫度、IPTG終濃度、誘導時間)以獲得大量可溶性目的蛋白。最終確定其表達優(yōu)化條件是:在OD_(600nm)=0.4,誘導溫度為20℃時,以終濃度為0.7 mmol/L的IPTG對含有重組表達載體的表達宿主誘導6 h。3抗EF-P重組蛋白的單克隆抗體的制備以純化的EF-P重組蛋白作為免疫抗原免疫Balb/c小鼠,進行細胞融合、陽性雜交瘤細胞的篩選、亞克隆篩選單細胞,最終通過體內(nèi)誘生法成功獲取5株小鼠腹水,且腹水效價在1:128000至1:512000之間。對其中的3D3號腹水進行分離純化及鑒定,最終獲得純度較高、特異性較好的抗EF-P重組蛋白的單克隆抗體。上述研究結(jié)果為后續(xù)研究嗜根考克氏菌DC2201天然EF-P翻譯后修飾方式、探究EF-P的翻譯后修飾對嗜根考克氏菌DC2201的生物學意義奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：江西師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q78;Q93
【圖文】：

的數(shù)量大約為 EF-G 的十分之一，并且每 10 個核糖體大約配有一個 EF-P[12]，基于此可推斷 EF-P 并不是每個核糖體的翻譯延伸過程都參與作用。另外細菌的 EF-P 與真核生物的 eIF5A 屬于同源蛋白質(zhì)。兩者具體的結(jié)構(gòu)如圖 1-1[11]所示：對比兩者可知，eIF5A 僅有兩個結(jié)構(gòu)區(qū)域，而 EF-P 存在三個結(jié)構(gòu)區(qū)域。EF-P 的 N-末端結(jié)構(gòu)域 I 和 II 相當于 eIF5A 其中的 N-和 C-末端結(jié)構(gòu)域，而另外的 C 末端結(jié)構(gòu)域 III 存在于細菌 EF-P 中，使得 EF-P 整體類似于 L 形的tRNA[11-13]。一方面，細菌 EF-P 的結(jié)構(gòu)域 II 和 III 之間的高結(jié)構(gòu)同源性表明 EF-P中的另外的結(jié)構(gòu)域 III 可能是由于重復(fù)而產(chǎn)生，其中 C-末端結(jié)構(gòu)域在細菌 EF-P之間顯示出更高的保守性。 另一方面，eIF-5A 的 C 末端的延伸與細菌 EF-P 的C 末端部分顯示出序列相似性。由此可推測在進化過程中可能是 eIF5A 丟失了C-端的重復(fù)部分。基于對兩種結(jié)構(gòu)的了解，目前存在爭論的主要是其進化的先后順序，即尚不清楚最后一個共同的祖先是僅有兩個結(jié)構(gòu)域也就是類似于 eIF-5A的結(jié)構(gòu)，隨后在細菌譜系中通過重復(fù)獲得了另外的結(jié)構(gòu)域 III，還是是有三個結(jié)構(gòu)域類似于細菌中的 EF-P，最后在進化過程中縮減為真核生物的兩個結(jié)構(gòu)域。

嗜根考克氏菌 DC2201 翻譯延伸因子 P 基因的克隆、表達及其單克隆抗體的制，制備的單克隆抗體可利用免疫親和柱及免疫雜交的方式釣取天然蛋研究嗜根考克氏菌 DC2201 天然 EF-P 翻譯后修飾方式奠定物質(zhì)基礎(chǔ) 在細菌中的翻譯后修飾方式的理論研究；其次，為探究 EF-P 翻譯后考克氏菌 DC2201 的生物學意義奠定實驗基礎(chǔ)。研究內(nèi)容及技術(shù)路線根據(jù)上述分析，本文的研究內(nèi)容主要分為以下幾方面：（1）嗜根考克氏菌 DC2201 EF-P 蛋白的生物信息學分析、表達及鑒（2）EF-P 重組蛋白誘導表達條件的優(yōu)化；（3）制備抗 EF-P 重組蛋白的單克隆抗體。具體的實驗研究路線如下圖 1-2 所示：

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