【摘要】：β-葡萄糖苷酶(β-D-glucoβyranoside glucohydrolases,E.C.3.2.1.21)能夠特異性催化水解小分子寡糖、烴基以及芳香基團(tuán)非還原性末端β-糖苷鍵生成葡萄糖,其作為纖維素酶的組分中主要的限速酶,對(duì)高效利用生物質(zhì)碳源有著重要意義。除此之外其在食品加工、養(yǎng)殖、生物醫(yī)學(xué)、種植等領(lǐng)域都有著重要使用價(jià)值,因此新型β-葡萄糖苷酶資源的開發(fā)具有深遠(yuǎn)的生產(chǎn)意義。本試驗(yàn)旨在通過從海南紅樹林環(huán)境中篩選出新型β-葡萄糖苷酶基因并通過研究其酶特性挖掘該酶資源的應(yīng)用潛力。主要研究結(jié)果如下:1.紅樹林土壤中產(chǎn)β-葡萄糖苷酶真菌的篩選、分離及鑒定試驗(yàn)采用七葉素苷平板法從海南紅樹林土壤中成功篩選出9株具有明顯β-葡萄糖苷酶活性的真菌,并選取其中一株活性較高真菌H1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),該菌在微晶纖維素誘導(dǎo)下,發(fā)酵液上清中酶活達(dá)到了 19.1 U/ml;菌株H1經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察和ITS序列測(cè)序鑒定屬于哈茨木霉(Trichoderma harzianum)。2.哈茨木霉bgl基因的克隆及在其在畢赤酵母中的表達(dá)以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中哈茨木霉IOC 3844的bgl基因(GenBank登錄號(hào)為:KU201604.1)為模板設(shè)計(jì)引物,利用反轉(zhuǎn)錄PCR從野生菌株H1中擴(kuò)增得到完整的bgl基因,以pPICZαA為表達(dá)載體將H1 bgl基因轉(zhuǎn)入畢赤酵母X33表達(dá)并測(cè)定最佳產(chǎn)酶周期,結(jié)果表明,H1 bgl片段全長(zhǎng)1398 bp,經(jīng)比對(duì)與數(shù)據(jù)庫(kù)中哈茨木霉IOC 3844β-葡萄糖苷酶同源性最高,達(dá)到96.07%,沒有發(fā)現(xiàn)100%一致率的序列。產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)測(cè)定最佳發(fā)酵周期為6d,最高活性為3.09 U/ml。3.哈茨木霉H1 bgl1蛋白的分離純化及其酶特性研究試驗(yàn)通過陰離子交層析成功純化H1bgl蛋白,并用SDS-PAGE和BCA法分別檢測(cè)蛋白純度和濃度,最后以pNPG為底物分別測(cè)定不同溫度和pH下H1bglβ-葡萄糖苷酶活性及酶反應(yīng)動(dòng)力參數(shù),結(jié)果表明,純化后酶液蛋白濃度為0.106 mg/ml,酶蛋白比活力為14 U/mg,SDS-PAGE檢測(cè)無明顯雜帶,分子量約80kD。最佳反應(yīng)pH為7.0,溫度為55℃,米氏常數(shù)Km=1.47 mM、專一性常數(shù)Kcat/Km=13.56(/s/mM)。綜上所述,試驗(yàn)成功從紅樹林哈茨木霉中發(fā)現(xiàn)了一種新型β-葡萄苷酶資源,該酶具有優(yōu)秀的堿性環(huán)境適應(yīng)性,但其催化效率相對(duì)較弱,有待于進(jìn)一步改造提升。
【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q55
【圖文】：

圖２菌株在七葉苷平板上產(chǎn)生的沉淀圈逡逑Ｆｉｇ邋２邋Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ邋ｒｉｎｇ邋ｐｒｏｄｕｃｅｄ邋ｂｙ邋ｔｈｅ邋ｓｔｒａｉｎ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｅｓｃｕｌｉｎ邋ｐｌａｔｅ逡逑表６七葉素苷板沉淀圈測(cè)定結(jié)果逡逑Ｔａｂｌｅ邋６邋Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｅｓｃｉｎ邋ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ邋ｐｌａｔｅ邋ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ邋ｒｉｎｇ逡逑邐沉淀圈直徑（ｃｍ）邐顏色深淺逡逑１．７９土邋０．０６邐＊＊＊＊逡逑１．５７邋土邋０．０３邐＊＊＊＊逡逑１．７３邋土邋０．１２邐＊＊＊＊逡逑０．７４＋０．０４邐…逡逑２邐１．１７土邋０．０４邐＊＊＊逡逑０．９３＋０．０２邐…逡逑０．６１邋土邋０．０１邐＊＊逡逑１．３９邋土邋０．０６邐…逡逑邐１．４１邋土邋０．１３邐…逡逑注：表示顏色深淺，越多表示顏色越深。逡逑

圖３對(duì)硝基苯粉標(biāo)準(zhǔn)曲線逡逑Ｆｉｇ邋３邋Ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ逡逑．２．２發(fā)酵液酶活測(cè)定逡逑將上述菌株以相同接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行同期發(fā)酵，每隔２４邋ｈ測(cè)定發(fā)酵逡逑上清中Ｐ－葡萄糖苷酶活性，共發(fā)酵７邋ｄ，選取各菌株發(fā)酵周期內(nèi)測(cè)定酶活最高值逡逑行對(duì)比，有３株菌株上清液中檢測(cè)到高活性，結(jié)果如表７所示。逡逑表７發(fā)酵液（６邋ｄ）上清中（５－葡萄糖昔酶活性逡逑Ｔａｂｌｅ邋５邋Ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｏｆ邋ｂｅｔａ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ邋ｉｎ邋ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ邋ｏｆ邋ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｂｒｏｔｈ邋（６邋ｄ）逡逑株編號(hào)邐最高酶活力（Ｕ／ｍｌ）逡逑－ｌ邐１２．８５邋土０．０４逡逑－ｌ邐１９．１０＋０．０６逡逑－２邐１０．７４邐土０．０３逡逑－ｌ邐—逡逑－２－２邐—逡逑－ｌ邐—逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2712596