【摘要】：目的:E_2泛素交聯(lián)酶RAD6在多種細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用,包括組蛋白泛素化修飾、DNA損傷修復(fù)和精子形成等;在哺乳動(dòng)物中,RAD6相關(guān)基因RAD6A與RAD6B,編碼蛋白高度同源。在本文中我們以RAD6B~(-/-)小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,對(duì)RAD6B基因缺失對(duì)小鼠生長(zhǎng)發(fā)育及雌性生殖的影響進(jìn)行深入研究。方法:1)、通過(guò)同窩RAD6B~(+/-)小鼠雜交獲得RAD6B~(-/-)小鼠,子代回交親本提高RAD6B~(-/-)小鼠比例,同窩野生型作為對(duì)照;2)、從出生起監(jiān)測(cè)小鼠體重變化及雌性生殖相關(guān)指標(biāo);3)、取小鼠垂體做冰凍切片并進(jìn)行HE染色,對(duì)比RAD6B~(+/+)與RAD6B~(-/-)小鼠垂體體積及質(zhì)量之間是差異;4)、分離小鼠外周血清,通過(guò)ELISA方法測(cè)定與生長(zhǎng)及生殖相關(guān)激素的分泌量;5)、提取垂體組織RNA,通過(guò)RT—PCR測(cè)定垂體五種特異性細(xì)胞的mRNA表達(dá)量;6)、對(duì)RAD6B~(+/+)與RAD6B~(-/-)小鼠進(jìn)行計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT),探究骨骼線性生長(zhǎng)發(fā)育差異;7)、分離和培養(yǎng)垂體原代細(xì)胞,CCK8測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線和激素分泌量;并用500uM H_2O_2誘導(dǎo)垂體原代細(xì)胞衰老、然后CCK8測(cè)定誘導(dǎo)后細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)及激素分泌量;8)、垂體組織冰凍切片β-半乳糖苷酶(β-Gal)染色檢測(cè)垂體細(xì)胞中β-Gal表達(dá)量;9)、免疫熒光(IF)染色觀察生長(zhǎng)激素(GH)細(xì)胞分布密度及P16陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量;10)、Western Blot測(cè)定GH(生長(zhǎng)激素)、P21、PRLR(泌乳素受體)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:RAD6B基因敲除小鼠出生時(shí)體重與野生型相比差異不明顯,但從1周齡開(kāi)始體重差異逐漸增大,3-4周齡體重差異最明顯(P0.01);然而從7周齡起體重差異逐漸減小直至消失(約10周齡)。垂體對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝、生殖等有重要影響,因此我們?nèi)⌒∈蟠贵w進(jìn)行組織學(xué)和形態(tài)學(xué)的差異探究,垂體稱重及HE結(jié)果顯示:RAD6B~(-/-)小鼠垂體組織質(zhì)量輕,垂體總體積小并且神經(jīng)垂體和垂體中葉體積與WT相比差異不明顯,說(shuō)明垂體體積差異主要出現(xiàn)在垂體前葉;除此之外,垂體GH(生長(zhǎng)激素)mRNA表達(dá)量下調(diào)(P0.01);且GH(生長(zhǎng)激素)免疫熒光染色(IF)結(jié)果表明垂體促生長(zhǎng)激素細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P0.001),GH(生長(zhǎng)激素)外周血分泌量也明顯下降(P0.05)。肝源性的IGF-1(胰島素樣因子-1)是GH(生長(zhǎng)激素)的下游蛋白,GH對(duì)體細(xì)胞生長(zhǎng)的影響是通過(guò)其直接作用和IGF-1的間接作用來(lái)實(shí)現(xiàn);RT-PCR結(jié)果顯示:3周齡小鼠垂體生長(zhǎng)激素(GH)及肝臟IGF-1 mRNA表達(dá)量下降均約50%(GH,P0.01,IGF-1,P0.05);GH(生長(zhǎng)激素)是GH(生長(zhǎng)激素)/IGF-1(胰島素樣因子)軸的關(guān)鍵組成因子,GH/IGF-1軸對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育與生殖起關(guān)鍵調(diào)控作用。CT結(jié)果表明:1)、RAD6B~(-/-)小鼠骨骼縱軸長(zhǎng)度(門齒至骶骨尾端)在4周齡時(shí)顯著短于RAD6B~(+/+)(P0.01),10周齡時(shí)差異消失,而24周齡(6月齡)差異再次出現(xiàn)(P0.01)。2)、4周齡時(shí)RAD6B~(-/-)小鼠的股骨與脛骨長(zhǎng)度同樣短于RAD6B~(+/+)小鼠(P0.01),10周齡小鼠股骨和脛骨的長(zhǎng)度差異逐漸減少趨于相等。3)、24周齡小鼠的股骨及脛骨沒(méi)有明顯差異;除此之外,我們還發(fā)現(xiàn)4周齡RAD6B~(-/-)小鼠的卵巢子宮、睪丸及乳腺發(fā)育不良;而垂體泌乳素(PRL)及其受體(PRLR)對(duì)乳腺發(fā)育、刺激和維持泌乳有至關(guān)重要的影響,因此我們測(cè)定垂體泌乳素(PRL)mRNA的表達(dá)量,結(jié)果顯示:泌乳素(PRL)mRNA的表達(dá)量略微增加(P0.05),然后我們提取乳腺組織蛋白及RNA,用WB及PT-PCR測(cè)定泌乳素受體(Prlr)蛋白及mRNA表達(dá)量,結(jié)果顯示RAD6B~(-/-)小鼠的垂體泌乳素受體蛋白及mRNA的表達(dá)量均下降(P0.01);且RAD6B~(-/-)雌性小鼠的第一次動(dòng)情期推遲、生殖間隔周期延長(zhǎng)、產(chǎn)仔量及母性行為下降。分離垂體原代細(xì)胞培養(yǎng)并用ROS(H_2O_2)誘導(dǎo)細(xì)胞衰老;我們發(fā)現(xiàn):未進(jìn)行任何處理的RAD6B~(-/-)垂體原代細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力弱于RAD6B~(+/+)(P0.05),加入500 uM H_2O_2誘導(dǎo)衰老后測(cè)定細(xì)胞增殖能力,結(jié)果表明:2小時(shí)時(shí)RAD6B~(-/-)垂體原代細(xì)胞的增殖能力略增加(P0.05),但4小時(shí)時(shí)增殖能力顯著下降(P0.05),此趨勢(shì)持續(xù)至增殖停止;加入500 uM H_2O_2后RAD6B~(+/+)與RAD6B~(-/-)垂體原代細(xì)胞的GH(生長(zhǎng)激素)的分泌量均下降,但RAD6B~(-/-)細(xì)胞的下降程度更明顯(P0.01)。接下來(lái)我們對(duì)6月齡小鼠垂體組織進(jìn)行P16熒光染色與β-Gal,并提取垂體蛋白測(cè)定P21的蛋白表達(dá)量;結(jié)果顯示:RAD6B KO小鼠的垂體β-Gal陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯多于WT(P0.001),P16的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量同樣多于WT(P0.01);而P21的蛋白表達(dá)量KO少于WT(P0.01)。結(jié)論:1)、RAD6B~(-/-)小鼠體重下降、垂體前葉體積減小與垂體前葉原代細(xì)胞增殖能力下降;并且垂體前葉促生長(zhǎng)激素細(xì)胞數(shù)量減少,GH(生長(zhǎng)激素)分泌量下降;以上結(jié)果表明:RAD6B基因缺失引起小鼠垂體發(fā)育不全,功能下降。2)、GH(生長(zhǎng)激素)蛋白及肝臟IGF-1(胰島素樣因子1)mRNA表達(dá)量下降,引起GH/IGF-1軸功能缺陷,導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育遲緩,生殖器官發(fā)育不全與青春期延遲(性成熟延遲)3)、乳腺泌乳素受體(PRLR)蛋白及mRNA表達(dá)量下降,導(dǎo)致乳腺發(fā)育不成熟。4)、加入ROS(H_2O_2)誘導(dǎo)劑后,垂體前葉垂體原代細(xì)胞增殖能力顯著下降并且GH(生長(zhǎng)激素)分泌量明顯下降;表明RAD6B基因缺陷導(dǎo)致垂體前葉細(xì)胞增殖能力下降、并導(dǎo)致垂體促生長(zhǎng)激素細(xì)胞功能下降5)、RAD6B~(-/-)小鼠的垂體組織中β-Gal和P16陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加,提示RAD6B基因缺失導(dǎo)致垂體細(xì)胞衰老。
【圖文】：

圖 1：RAD6B 敲除鼠垂體功能低下。圖 A：分別取出生后 21 天的 RAD6 基因缺失小鼠和野生型小鼠拍照對(duì)比身形差異；圖 B： RAD6B KO 和 WT 小鼠的體重（*P<0.05,**P<0.01）；圖 C：解剖 RAD6B-/-小鼠（雌雄各 3-5 只）和 RAD6B+/+小鼠（雌雄各 3-5 只）取臟器進(jìn)行稱重

促生長(zhǎng)激素細(xì)胞的數(shù)量?jī)H約 RAD6B+/+的 30%（P<0.05），并且熒光強(qiáng)度弱于 RAD6B+/+小鼠（圖2A）；隨后，我們用蛋白免疫印跡（WB）和 ELISA 的方法測(cè)定 GH 在垂體的蛋白表達(dá)量與 GH 在外周血的分泌量，結(jié)果顯示：RAD6B-/-小鼠垂體生長(zhǎng)激素蛋白的表達(dá)量顯著低于 RAD6B+/+小鼠（圖 1C,D P<0.001）；且外周血生長(zhǎng)激素的分泌量下降，約為 RAD6B+/+小鼠的 65%（圖 1E，P<0.001）。緊接著我們測(cè)定了 GH 依賴性肝臟源 IGF-1 的 mRNA 表達(dá)水平，，因?yàn)?GH 分泌的脈沖性質(zhì)，其隨機(jī)循環(huán)水平而不能準(zhǔn)確地反映 GH 的效率。統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與 RAD6B+/+小鼠相比，RAD6B-/-肝臟 IGF-1 mRNA 的表達(dá)量降低約 50％（圖 1F P<0.05）。由以上表明：RAD6B 基因缺失導(dǎo)致垂體促生長(zhǎng)激素細(xì)胞數(shù)量下降
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q344

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本文編號(hào)：2711742