【摘要】：紅球菌作為一類耐有機(jī)溶劑的極端微生物,在生物轉(zhuǎn)化和生物修復(fù)等領(lǐng)域具有潛在作用。挖掘赤紅球菌SD3菌株有機(jī)溶劑響應(yīng)相關(guān)蛋白并進(jìn)行功能表征,有利于加深對微生物有機(jī)溶劑耐受性機(jī)制的理解,也能促進(jìn)微生物在有機(jī)相催化反應(yīng)中的應(yīng)用。本研究的主要內(nèi)容和結(jié)果如下:1)通過iTRAQ標(biāo)記技術(shù)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法分析了赤紅球菌SD3菌株在甲苯和苯酚脅迫下響應(yīng)情況。與對照組相比,分別鑒定出362和488個差異蛋白。同時挖掘了赤紅球菌SD3菌株的有機(jī)溶劑耐受性相關(guān)的應(yīng)激蛋白、膜蛋白、調(diào)控系統(tǒng)和代謝途徑。此外,應(yīng)用qPCR在轉(zhuǎn)錄水平上證明甲苯或苯酚脅迫下,赤紅球菌SD3菌株的CspA家族應(yīng)激蛋白、4-硝基苯酚2-單加氧酶和二鳥苷酸環(huán)化酶的表達(dá)水平發(fā)生了上調(diào)。2)通過克隆赤紅球菌SD3的二鳥苷酸環(huán)化酶基因dgc,利用生物信息學(xué)手段對二鳥苷酸環(huán)化酶(diguanylate cyclase,DGC)的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析,初步判斷DGC蛋白是含6段跨膜區(qū)的疏水性蛋白,含有50%以上的穩(wěn)定α螺旋結(jié)構(gòu),具有典型的GGDEF催化活性結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹分析表明赤紅球菌SD3和食醚紅球菌的DGC親緣關(guān)系較近,推測赤紅球菌SD3的DGC也屬于Class III nucleotidyl cyclases家族,具有類似的分子功能。通過I-TASSER建模工具得到了DGC蛋白的三級結(jié)構(gòu),利用分子對接技術(shù)模擬了底物GTP與DGC蛋白通過疏水作用和氫鍵產(chǎn)生相互作用,從而形成穩(wěn)定結(jié)合的構(gòu)象。3)為了進(jìn)一步研究赤紅球菌SD3有機(jī)溶劑響應(yīng)相關(guān)蛋白二鳥苷酸環(huán)化酶的功能和合成c-di-GMP的活力。對赤紅球菌SD3中的dgc基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化,構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pPGH-Dgcs,并轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)進(jìn)行異源表達(dá)。通過優(yōu)化表達(dá)條件,在16℃和0.1 mM IPTG誘導(dǎo)條件下,融合GST標(biāo)簽以幫助DGC膜蛋白的正確折疊和異源表達(dá)。經(jīng)谷胱甘肽瓊脂糖親和層析純化得到一個新的全長GST-DGC融合蛋白,并由LC-MS/MS分析確定為目的蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法鑒定GST-DGC蛋白的大小為71.9 kDa,與理論值73.0 kDa大致相符。Blue Native PAGE結(jié)果表明GST-DGC融合蛋白形成了八聚體。GST-DGC酶的最適反應(yīng)pH值和最適反應(yīng)溫度分別為8.0和47°C,并且表現(xiàn)出高熱穩(wěn)定性,在87℃孵育1 h后,依然保留了94%的活性。此外,GST-DGC融合蛋白也表現(xiàn)出pH穩(wěn)定性。該酶催化GTP底物生成c-di-GMP的反應(yīng)動力學(xué)分析表明,其Km、Vmax和Kcat值分別為9.8μM、0.7μM/min和1.3 S~(-1)。一些金屬離子如Zn~(2+)、Mn~(2+)、Fe~(2+)、Ni~(2+)和Co~(2+)對GST-DGC蛋白質(zhì)有抑制作用,而金屬離子Mg~(2+)、K~+和Na~+和螯合劑EDTA則對GST-DGC蛋白質(zhì)有激活作用。更重要的是,該融合蛋白在甲苯、環(huán)己烷和正己烷存在下也顯示出相當(dāng)高的穩(wěn)定性。進(jìn)一步應(yīng)用分子對接方法預(yù)測了GST-DGC蛋白可能的金屬離子和有機(jī)溶劑激活或抑制位點(diǎn),為酶分子的定點(diǎn)改造以提高c-di-GMP產(chǎn)量提供靶點(diǎn)�？傊�,本研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)和熒光定量PCR初步證明了二鳥苷酸環(huán)化酶與微生物有機(jī)耐受性的關(guān)系。首次異源表達(dá)得到紅球菌中含有6段跨膜區(qū)的完整二鳥苷酸環(huán)化酶,與已報道的海棲熱袍菌嗜熱二鳥苷酸環(huán)化酶的Kcat值2.6 min~(-1)相比,本研究純化得到GST-DGC融合蛋白催化合成c-di-GMP效率提高了約30倍。本研究為大規(guī)模催化合成c-di-GMP提供了可能,為揭示二鳥苷酸環(huán)化酶與微生物有機(jī)耐受性的關(guān)聯(lián)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：江西師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q93

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 吳珊珊;朱蕓;陳珊珊;何冰芳;;融合標(biāo)簽在蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)中的應(yīng)用進(jìn)展[J];化工進(jìn)展;2014年04期

2 王啟明;彭仁;陳文靜;杜蕓蕓;楊貴娟;簡敏菲;;苯酚降解菌的篩選及降解性能研究[J];江西師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2012年03期

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本文編號：2710074