【摘要】：紅球菌作為一類耐有機溶劑的極端微生物,在生物轉化和生物修復等領域具有潛在作用。挖掘赤紅球菌SD3菌株有機溶劑響應相關蛋白并進行功能表征,有利于加深對微生物有機溶劑耐受性機制的理解,也能促進微生物在有機相催化反應中的應用。本研究的主要內容和結果如下:1)通過iTRAQ標記技術和液相色譜-串聯(lián)質譜方法分析了赤紅球菌SD3菌株在甲苯和苯酚脅迫下響應情況。與對照組相比,分別鑒定出362和488個差異蛋白。同時挖掘了赤紅球菌SD3菌株的有機溶劑耐受性相關的應激蛋白、膜蛋白、調控系統(tǒng)和代謝途徑。此外,應用qPCR在轉錄水平上證明甲苯或苯酚脅迫下,赤紅球菌SD3菌株的CspA家族應激蛋白、4-硝基苯酚2-單加氧酶和二鳥苷酸環(huán)化酶的表達水平發(fā)生了上調。2)通過克隆赤紅球菌SD3的二鳥苷酸環(huán)化酶基因dgc,利用生物信息學手段對二鳥苷酸環(huán)化酶(diguanylate cyclase,DGC)的理化性質和結構特征進行分析,初步判斷DGC蛋白是含6段跨膜區(qū)的疏水性蛋白,含有50%以上的穩(wěn)定α螺旋結構,具有典型的GGDEF催化活性結構域。進化樹分析表明赤紅球菌SD3和食醚紅球菌的DGC親緣關系較近,推測赤紅球菌SD3的DGC也屬于Class III nucleotidyl cyclases家族,具有類似的分子功能。通過I-TASSER建模工具得到了DGC蛋白的三級結構,利用分子對接技術模擬了底物GTP與DGC蛋白通過疏水作用和氫鍵產生相互作用,從而形成穩(wěn)定結合的構象。3)為了進一步研究赤紅球菌SD3有機溶劑響應相關蛋白二鳥苷酸環(huán)化酶的功能和合成c-di-GMP的活力。對赤紅球菌SD3中的dgc基因進行密碼子優(yōu)化,構建了重組表達質粒pPGH-Dgcs,并轉入E.coli BL21(DE3)進行異源表達。通過優(yōu)化表達條件,在16℃和0.1 mM IPTG誘導條件下,融合GST標簽以幫助DGC膜蛋白的正確折疊和異源表達。經谷胱甘肽瓊脂糖親和層析純化得到一個新的全長GST-DGC融合蛋白,并由LC-MS/MS分析確定為目的蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法鑒定GST-DGC蛋白的大小為71.9 kDa,與理論值73.0 kDa大致相符。Blue Native PAGE結果表明GST-DGC融合蛋白形成了八聚體。GST-DGC酶的最適反應pH值和最適反應溫度分別為8.0和47°C,并且表現出高熱穩(wěn)定性,在87℃孵育1 h后,依然保留了94%的活性。此外,GST-DGC融合蛋白也表現出pH穩(wěn)定性。該酶催化GTP底物生成c-di-GMP的反應動力學分析表明,其Km、Vmax和Kcat值分別為9.8μM、0.7μM/min和1.3 S~(-1)。一些金屬離子如Zn~(2+)、Mn~(2+)、Fe~(2+)、Ni~(2+)和Co~(2+)對GST-DGC蛋白質有抑制作用,而金屬離子Mg~(2+)、K~+和Na~+和螯合劑EDTA則對GST-DGC蛋白質有激活作用。更重要的是,該融合蛋白在甲苯、環(huán)己烷和正己烷存在下也顯示出相當高的穩(wěn)定性。進一步應用分子對接方法預測了GST-DGC蛋白可能的金屬離子和有機溶劑激活或抑制位點,為酶分子的定點改造以提高c-di-GMP產量提供靶點�？傊�,本研究通過蛋白質組學和熒光定量PCR初步證明了二鳥苷酸環(huán)化酶與微生物有機耐受性的關系。首次異源表達得到紅球菌中含有6段跨膜區(qū)的完整二鳥苷酸環(huán)化酶,與已報道的海棲熱袍菌嗜熱二鳥苷酸環(huán)化酶的Kcat值2.6 min~(-1)相比,本研究純化得到GST-DGC融合蛋白催化合成c-di-GMP效率提高了約30倍。本研究為大規(guī)模催化合成c-di-GMP提供了可能,為揭示二鳥苷酸環(huán)化酶與微生物有機耐受性的關聯(lián)機制奠定基礎。
【學位授予單位】：江西師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q93

【參考文獻】

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1 吳珊珊;朱蕓;陳珊珊;何冰芳;;融合標簽在蛋白質可溶性表達中的應用進展[J];化工進展;2014年04期

2 王啟明;彭仁;陳文靜;杜蕓蕓;楊貴娟;簡敏菲;;苯酚降解菌的篩選及降解性能研究[J];江西師范大學學報(自然科學版);2012年03期

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本文編號：2710074