【摘要】：可變剪接指同一基因在轉(zhuǎn)錄后,不同外顯子的剪接形式使得同一基因的表達產(chǎn)物有著不同的剪接異構(gòu)體,常對應著不同的功能。EZH2作為表觀調(diào)控元件PRC2復合體的重要組成部分,參與細胞生命活動的調(diào)節(jié)。EZH2的剪接異構(gòu)體在細胞內(nèi)有著多種形式,一種被人們忽視的剪接異構(gòu)體形式EZH2-X9在SD生物體內(nèi)有著廣泛表達,具體功能尚不明確。目的:1.分離鑒定出EZH2-X9型剪接異構(gòu)體,對核酸序列、氨基酸序列進行比對分析;2.探究EZH2-X9型剪接異構(gòu)體在細胞和SD大鼠中的表達分布以及隨著個體發(fā)育過程中不同組織中表達量的變化;3.初步探究EZH2-X9型剪接異構(gòu)體在細胞中與普通的全長EZH2相比功能上所具有的異同點。方法:1.在PC12細胞和SD大鼠中,通過PCR技術(shù)和基因測序?qū)ふ褽ZH2-X9剪接異構(gòu)體的核酸表達,結(jié)合MUSCLE和BLAST對核酸及氨基酸序列進行分析;2.通過非放射性原位雜交技術(shù)(FISH)、免疫細胞化學技術(shù)(IF)、實時定量基因擴增熒光檢測(q-PCR)以及蛋白質(zhì)印記(WB)研究EZH2-X9剪接異構(gòu)體在細胞內(nèi)的表達以及分布;在SD大鼠中,通過特異性引物的設(shè)計和使用,q-PCR對不同組織中的mRNA表達分布進行研究,并利用WB檢測蛋白表達的同步性。3.在未分化的PC12細胞中,結(jié)合基因工程的手段,通過熒光顯微鏡觀察分析并統(tǒng)計細胞的變化,探究EZH2-X9剪接異構(gòu)體對NGF誘導的細胞分化過程中所起到的具體功能影響。4.在PC12細胞內(nèi),通過降解同源序列靶基因mRNA的基因敲低(KD)方式,分別阻止普通EZH2-WT和EZH2-X9剪接異構(gòu)體的表達,結(jié)合WB和蛋白質(zhì)免疫共沉淀(IP)探究EZH2-WT和EZH2-X9剪接異構(gòu)體在細胞內(nèi)的功能差異性。結(jié)果:1.EZH2-X9在SD大鼠體內(nèi)廣泛分布,在細胞水平上EZH2-X9剪接異構(gòu)體主要分布于細胞核內(nèi)。2.在SD大鼠體內(nèi),EZH2-WT和EZH2-X9在不同組織中的表達量有著一定的差異性,腦中表達量和肺、心、肝相比較高;二者在同一組織中隨著個體發(fā)育時間的增長而衰減,且蛋白表達量同步。3.在PC12細胞中分別過表達和KD二者后,在mRNA水平上發(fā)現(xiàn)二者有著相互影響;EZH2-X9對于組蛋白H3第27位賴氨酸的甲基化作用沒有顯著的影響,IP實驗發(fā)現(xiàn)EZH2-X9能和EZH2-WT競爭結(jié)合EED,組成PRC2復合體;4.EZH2-WT和EZH2-X9對與細胞分化都有著重要的功能,在NGF誘導下未分化PC12細胞分化過程中,在KD-EZH2-X9時細胞的突起生長總長度、突起生長平均長度、突起生長數(shù)目、NOI%相比KD-EZH2-WT都有著更為顯著的降低;KD-EZH2-X9會提高UIR1、MapLC3和GSK的表達。結(jié)論:1.EZH2-X9主要存在于SD大鼠的腦中,呈發(fā)育期差異表達;2.EZH2-X9和和EZH2-WT競爭結(jié)合EED,組成PRC2復合體卻不能介導H3K27me3;3.EZH2-X9和EZH2-WT通過調(diào)控不同的靶基因和分子途徑調(diào)節(jié)細胞生長。
【圖文】：

第二章 EZH2-WT 和異構(gòu)體 EZH2-X9 序列對比 實驗結(jié)果.1 EZH2 在生物體內(nèi)的各種剪接形式在中央神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)展過程中，EZH2 起到了不可替代的重要作用。測序和對不同序列的比對分析，，目前已經(jīng)在 SD 大鼠中被研究發(fā)現(xiàn)的剪接體有八種，分別被命名為 EZH2-WT、EZH2-X1 X8，對應的各2.1 所示。從結(jié)構(gòu)上分析可以得知不同的外顯子的間接可以獲得不同的則有可能被翻譯形成具有不同一級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。但是在中央神經(jīng)發(fā)現(xiàn)的 EZH2 蛋白只有 EZH2-WT 序列對應結(jié)構(gòu)的，這表明其它的結(jié)可能是一種錯誤的剪接形式。

10圖 2.2 EZH2-WT、X9 序列比對Figure 2.2 Sequence alignment of EZH2-WT and X9關(guān)于 EZH2-WT 的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)分析，V3 區(qū)域位于 EZH2-WT 蛋白的 CXC區(qū)域。這一區(qū)域的氨基酸組成上是一種富含 cystein 的區(qū)域，大量的半胱氨酸缺失表明 EZH2-X9 相對于 EZH2-WT 而言可能會缺乏 CXC 區(qū)域?qū)南嚓P(guān)功能。EZH2-WT 蛋白的各區(qū)域相關(guān)功能如圖所示，Exon-V3 的位置如圖 2.2（a） 所示。關(guān)于 EZH2-WT 的氨基酸序列和 EZH2-X9 的可能氨基酸序列進行比對的結(jié)果，如圖 2.2（b）所示，其中 Exon-V3 片段的氨基酸序列見方框中所示。以 SD 大鼠全腦提取的總 RNA 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板進行 PCR 擴增，隨后的瓊脂糖凝膠電泳進一步發(fā)現(xiàn)有兩條明亮的條帶，如圖 2.3（a）。從 Marker 的分子量進行初步判斷，與 DNA 帶的位置與 EZH 2-WT 和 EZH2-X9 的預期大小非常吻合，說明 EZH 2-WT 和 X9 是在大鼠腦內(nèi)表達的真正的 EZH 2 轉(zhuǎn)錄本。
【學位授予單位】：合肥工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q78

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本文編號：2708523