【摘要】：磷(phosphorus)是植物生存所必須的營養(yǎng)元素,細胞內1/3的有機磷都以磷脂的形式儲存。當遭受磷脅迫時,植物細胞會將細胞膜上的磷脂替換為糖脂,這種脂質重塑(lipid remodeling)的過程需要大量糖脂的參與,目前還尚不清楚甘油脂從頭合成途徑是否涉及其中。擬南芥質體3-磷酸甘油�；D移酶(ATS1)是甘油脂原核合成途徑中催化3-磷酸甘油第一步�；磻年P鍵酶,它以質體內的脂酰-ACP為底物。酶學分析發(fā)現(xiàn),ATS1也可以利用細胞質中的脂酰-CoA為底物催化3-磷酸甘油的�；磻�。由于ATS1是一個氨基端帶有轉運肽的可溶性蛋白,目前還尚不清楚其是否可以參與質體外甘油脂的真核合成途徑。本研究通過將ATS1在擬南芥細胞質中表達,探究ATS1異位表達與質體外甘油脂合成途徑的聯(lián)系,初步探討增強甘油脂合成對擬南芥磷脅迫響應的影響,主要實驗結果如下:1.通過將ATS1的氨基酸序列與多個物種的質體3-磷酸甘油�；D移酶氨基酸序列進行比對分析,推測ATS1的轉運肽序列為氨基端90個氨基酸殘基。使用酵母遺傳互補體系對截去氨基端90個氨基酸殘基的ATS1進行酶活性分析,發(fā)現(xiàn)不帶轉運肽的ATS1可以恢復雙突變體酵母因3-磷酸甘油酰基轉移酶活性缺失導致的生長缺陷,表示不帶轉運肽的ATS1仍具有3-磷酸甘油�；D移酶活性。此外,不帶轉運肽的ATS1在酵母中的酶活性要高于帶轉運肽的ATS1,說明此時不帶轉運肽的ATS1是一個成熟型蛋白。2.將帶轉運肽和不帶轉運肽序列的ATS1轉入atgpat1突變體擬南芥中,雖然兩種ATS1均未能回復atgpat1突變體雄性不育的異常表型,但是與atgpat1突變體相比,不帶轉運肽序列的ATS1轉基因株系種子的含油量平均增加了13.5%,其中C18:1、C18:3和C20:1脂肪酸的相對含量顯著增加,C18:2脂肪酸的相對含量顯著減少,以上結果與帶轉運肽序列的ATS1轉基因株系的種子油脂變化相似,說明不帶轉運肽的ATS1在擬南芥中仍然具有3-磷酸甘油�；D移酶活性。3.構建兩種ATS1的組成型表達載體,將他們分別導入到野生型擬南芥中。通過抗性篩選和DNA分子鑒定獲得T_3代不帶轉運肽序列的ATS1過表達純合單拷貝株系6株、T_3代帶轉運肽序列的ATS1過表達純合單拷貝株系5株。熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn),上述所有轉基因株系中ATS1的表達量都高于空載轉基因對照,從中選取4個高表達量的不帶轉運肽序列的ATS1轉基因株系、3個高表達量的帶轉運肽序列的ATS1轉基因株系用于后續(xù)實驗的研究。4.對帶轉運肽序列和不帶轉運肽序列的ATS1過表達株系的葉片進行油脂分析。結果表明,與帶轉運肽序列的ATS1過表達株系相比,不帶轉運肽序列的ATS1過表達株系葉片中的C16:0、C16:3脂肪酸相對含量顯著減少,C18:0、C18:2和C18:3脂肪酸相對含量顯著增加;此外,不帶轉運肽序列的ATS1過表達株系葉片MGDG的脂肪酸組分與空載轉基因對照沒有差異。上述結果表明ATS1異位表達可以影響質體外甘油脂的從頭合成。5.對帶轉運肽序列和不帶轉運肽序列的ATS1過表達株系進行了磷脅迫處理,發(fā)現(xiàn)在低磷脅迫下,兩種轉基因株系的根冠比及葉綠素含量都顯著高于空載轉基因對照,說明增強甘油脂從頭合成可以減輕低磷脅迫對擬南芥造成的損傷。6.外源甘油供應會增加細胞內3-磷酸甘油的合成,使細胞內游離磷酸鹽的含量下降,進而導致植物處于磷脅迫狀態(tài)。為了進一步探究甘油脂從頭合成對植物磷脅迫響應的影響,對帶轉運肽和不帶轉運肽序列的ATS1過表達株系進行了甘油處理。當供應0.01%(v/v)的甘油時,不帶轉運肽序列的ATS1過表達株系的主根長度顯著長于帶轉運肽序列的ATS1過表達株系,暗示著增強質體外甘油脂從頭合成可能提高了植物抵御磷脅迫的能力。上述研究結果表明,截去氨基端90個氨基酸殘基的ATS1是一個成熟蛋白,其可以增強質體外甘油脂從頭合成途徑,進而有助于提高植物對耐磷脅迫的響應能力,但其中的具體機制還需要進一步的研究。
【圖文】：

圖 1.1 擬南芥甘油脂類的生物合成途徑Figure 1.1 The pathways of glycerolipids biosynthesis in A. thaliana注：G-3-P：3-磷酸甘油；LPA：溶血磷脂酸；PA：磷脂酸；DAG：二酰甘油；CDP：胞嘧啶核苷二磷酸；PE：磷脂酰乙醇胺；PC：磷脂酰膽堿；PS：磷脂酰絲氨酸；PI：磷脂酰肌醇；PG：磷脂酰甘油；CL：心磷脂；PGP：磷脂酰甘油磷酸；MGDG：單半乳糖基甘油二酯；DGDG：雙半乳糖基甘油二酯；Ser：絲氨酸；Etn：乙醇胺；EtnP：磷酸乙醇胺；MMEtnP：磷酸單甲基乙醇胺；DMEtnP：磷酸雙甲基乙醇胺；CDP-MME：CDP-單甲基乙醇胺；CDP-DME：CDP-雙甲基乙醇胺；PMME：磷脂酰單甲基乙醇胺；PDME：磷脂酰雙甲基乙醇胺；Cho：膽堿；ChoP：磷酸膽堿。GPAT：3-磷酸甘油�；D移酶；LPAT：溶血磷脂酸�；D移酶；CDS：CDP-二酰甘油合成酶；PAH：磷脂酸磷酸酶；SDC：絲氨酸脫羧酶；EK：乙醇胺激酶；PECT：磷酸乙醇胺胞苷酸�；D移酶；AAPT：氨基-醇磷酸轉移酶；CCT：磷酸膽堿胞苷酰基轉移酶；PSD：磷脂酰絲氨酸脫羧酶；CK：膽堿激酶；PEAMT：磷脂酰乙醇胺 N-甲基轉移酶；PLMT：磷脂-N-甲基轉移酶；PMEAMT：磷酸甲基乙醇胺-N-甲基轉移酶；PGPS：磷脂酰甘油磷酸合成酶；PGPP：磷酸磷脂酰甘油磷酸酶；CLS：心磷脂合酶；PIS：磷脂酰肌醇合酶；MGD：單半乳糖甘油二酯合酶；DGD：雙半乳糖甘油二酯合酶。Note: G-3-P: glycerol-3-phosphate. LPA: lysobisphosphatidic acids. PA: Phosphatidic acid. DAG: diacylglycerol. CDP:cytidyldiphosphate. PE: phosphatidylethanolamine. PC: phosphatidylcholine. PS: phosphatidylserine. PI:

注： - 表示無數(shù)據(jù)。Note: - means no data.目前已知的大部分脂質轉運模型都是通過研究酵母（Saccharomyces cerevisiae）得來的，對于植物細胞內脂質轉運的研究還相對較少�？傮w而言，脂質運輸可以分為以下四種模型：(A)單分子脂質的擴散（diffusion）；(B)利用脂質轉運蛋白（lipidtransferproteins, LTPs）進行脂質分子的轉運；(C)通過運輸小泡（transport vesicle）將脂質分子從一層膜融合到另一層膜上；(D)膜與膜之間緊密接觸（10-30nm）形成膜連接部位（membrane contact sites, MCSs），協(xié)助脂質分子的跨膜運輸[4]（圖 1.2）。微粒體（蓖麻） 47 31 14 2 4 2葉綠體（花椰菜） 55 6 14 - 23 2過氧化物酶體（蓖麻）54 29 10 2 3 2液泡膜（綠豆） 47 32 11 5 5 -細胞質膜（綠豆） 47 35 5 8 5 -
【學位授予單位】：浙江農(nóng)林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q943.2;Q945.78

【參考文獻】

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1 陳娜,郭尚敬,顏坤,董新純,孟慶偉;甜椒甘油-3-磷酸�；D移酶基因的克隆與表達分析[J];園藝學報;2005年05期

2 常勝合,舒海燕,秦廣雍,吳玉萍,趙海珍;植物對磷饑餓的反應研究進展[J];中國農(nóng)學通報;2005年07期

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本文編號：2706913