【摘要】：尼古丁(Nicotine)具有高毒性,可透過生物膜,化學結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,并且是致癌物質(zhì)煙草特有亞硝胺(TSNAs)的重要前體物,存在于環(huán)境中不易降解,嚴重污染環(huán)境。由于其特殊的水溶性,能夠與水以任意比例互溶,對人類生活及生態(tài)環(huán)境是一個極大的威脅。針對降解高毒、高危害的尼古丁微生物種類較少的實際情況,篩選出一株新的具有高尼古丁降解活性的菌株,探究其降解特性;研究了該菌的降解過程,對其降解條件進行中心響應面優(yōu)化;通過全基因組測序,分析并確定尼古丁相關基因簇,初步構(gòu)建ZUC-3尼古丁代謝途徑,并對降解關鍵基因進行功能鑒定。旨在為尼古丁的生物降解相關領域及降解機制的研究提供新的微生物資源和理論依據(jù),研究結(jié)果表明:從煙草種植大田土壤分離純化得到一株具有高尼古丁降解能力的菌株,對其形態(tài)學、生理生化特征、16S rRNA基因序列同源性進行了分析鑒定,探究了不同條件下尼古丁降解特性并對其動態(tài)降解過程進行了HPLC分析。經(jīng)鑒定命名為寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas sp.ZUC-3,單因素試驗結(jié)果顯示其適宜的降解條件為:溫度30℃、起始pH 7.0、接種量10%、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180 r/min,此條件下尼古丁降解率可達到91.53%,HPLC分析顯示ZUC-3降解尼古丁過程的動態(tài)變化及其高效性。在寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas sp.ZUC-3降解尼古丁的Box-Behnken中心響應面優(yōu)化試驗中,添加適量的蛋白胨和NH_4NO_3作為氮源,補充少量的葡萄糖和無機鹽,通過PB(Plackett-Burman)試驗篩選出對尼古丁降解率影響最顯著的三個因素是:溫度、時間和攪拌轉(zhuǎn)速。在PB試驗結(jié)果的基礎上,下一步進行最陡爬坡試驗設計,由PB試驗結(jié)果設定爬坡方向與步長,逼近最優(yōu)區(qū)域,得到中心點為:溫度37℃,時間32 h,攪拌轉(zhuǎn)速150 r/min,以此為中心點設計Box-Benhnken響應面優(yōu)化試驗,構(gòu)建優(yōu)化模型得到最佳條件為:溫度30.13℃,時間35.41 h、攪拌轉(zhuǎn)速183.32 r/min,尼古丁降解率理論值為98.34%,并以此條件進行實際降解試驗,得到實際尼古丁降解率為99.13%,擬合度達到99.20%,相比優(yōu)化前尼古丁降解率顯著提高。對高效尼古丁降解菌Stenotrophomonas sp.ZUC-3進行全基因組測序及分析,基因組組裝共獲得90個Contigs,ZUC-3基因組大小為6.08 Mb,共得到5519條CDS序列,tRNA數(shù)量為74。通過與已知尼古丁降解相關基因的BLAST比對,預測ZUC-3尼古丁降解相關基因的功能,ZUC-3尼古丁相關基因主要位于Contig3上,繪制出ZUC-3尼古丁降解基因簇,初步構(gòu)建ZUC-3菌株尼古丁代謝途徑。通過qRT-PCR測定ZUC-3降解途徑上9個降解基因的表達水平,結(jié)果表明,當尼古丁存在時,9個降解基因的表達均顯著上調(diào)。對ZUC-3中降解關鍵基因hspB進行分子克隆和功能驗證,通過PCR擴增獲得hspB基因,以pET 22b為載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET 22b-hspB,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL 21(DE3)進行異源表達,采用SDS-PAGE進行表達驗證和檢測,并對Hsp-B酶活進行測定。構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pET22b-hspB并成功表達HspB蛋白,其分子量為43.97 kDa,通過試驗檢測其表達形式為包涵體,酶促反應結(jié)果表明HspB蛋白具有較高的6-羥基-3-琥珀酰吡啶單加氧酶活性,明確了HspB的生物學功能和活性。
【圖文】：

圖 1.1 尼古丁 R/S 構(gòu)型化學結(jié)構(gòu)式的危害及毒性作為中樞神經(jīng)興奮劑的一種,吸食后可以使人產(chǎn)生心理和成癮性物質(zhì)。成年人一次吸入 50-60 mg 的尼古丁即可導尼古丁,可痹抑心臟[13]、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)。而且還會使稠度增加、心臟的供血量減緩、產(chǎn)生心絞痛,嚴重時能引

2 一株新的尼古丁降解菌的分離鑒定及降解特性與分析丁降解菌 ZUC-3 的分離及對尼古丁降解作用古丁為唯一碳氮源的尼古丁培養(yǎng)基，經(jīng)過初篩與復篩，從湖南省大田土壤樣品中分離得到 1 株具有高活性尼古丁降解能力將 ZUC-3 以 5 %的接種量接入尼古丁培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min 后，測定發(fā)酵液中尼古丁濃度及吸收光譜，結(jié)果如圖 2.1 所示： 259 nm 存在明顯的吸收峰，當接入 ZUC-3 菌株發(fā)酵 48 h 后，明 ZUC-3 具有尼古丁降解能力。而且發(fā)酵液顏色在降解過程中：初期沒有發(fā)生顏色變化，當培養(yǎng)至 12 h 左右發(fā)酵液顏色開始增加顏色逐漸變深呈墨綠色，24 h 左右墨綠色開始褪去，發(fā)酵液，這與目前已報道的微生物降解尼古丁過程中的發(fā)酵液顏色變化尼古丁降解過程中生成的中間產(chǎn)物可能不同。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：X592;X172

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本文編號：2704130