【摘要】：造血干細(xì)胞(HSC)是血液系統(tǒng)各細(xì)胞組分的共同祖細(xì)胞,它通過(guò)不斷增殖和有序分化,形成了整個(gè)血液組分,同時(shí)通過(guò)持續(xù)的自我更新維持著造血干細(xì)胞和整個(gè)血液譜系的穩(wěn)態(tài)。造血干細(xì)胞形成、維持、增殖以及分化的缺陷會(huì)導(dǎo)致多種血液系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)的疾病,如白血病、貧血、類(lèi)風(fēng)濕和紅斑狼瘡等。因此,造血干細(xì)胞的正常形成對(duì)于機(jī)體的健康起著至關(guān)重要的作用。與此同時(shí),治療血液系統(tǒng)疾病的一個(gè)重要方法是造血干細(xì)胞移植,對(duì)于造血干細(xì)胞的形成和調(diào)控機(jī)制需深入認(rèn)知,體外誘導(dǎo)造血干細(xì)胞的生成及擴(kuò)增是實(shí)現(xiàn)移植治療的先決條件。所以,關(guān)于造血干細(xì)胞的相關(guān)研究,尤其是造血干細(xì)胞的起源過(guò)程、譜系分化和細(xì)胞形成的分子調(diào)控機(jī)制的研究一直以來(lái)都是生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。通過(guò)對(duì)小鼠等模式動(dòng)物進(jìn)行深入的研究,研究者發(fā)現(xiàn)原始造血發(fā)生在卵黃囊,這些血液細(xì)胞短暫存在并主要分化為原始紅系和髓系祖細(xì)胞。隨著胚胎的發(fā)育定向造血出現(xiàn)在AGM中,因?yàn)樽钤鐧z測(cè)到造血干細(xì)胞的出現(xiàn)而被認(rèn)為是造血干細(xì)胞產(chǎn)生的位置,其中一部分位于主動(dòng)脈腹側(cè)壁的血管內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)特化為生血內(nèi)皮細(xì)胞并在特定的胚胎發(fā)育時(shí)間窗,通過(guò)內(nèi)皮-造血轉(zhuǎn)化過(guò)程(EHT)分化為造血干細(xì)胞。近年來(lái)通過(guò)檢測(cè)造血干細(xì)胞的標(biāo)記分子,譜系追蹤和移植等一系列實(shí)驗(yàn),科研工作者發(fā)現(xiàn)胚胎期小鼠的腦血管也能夠原位產(chǎn)生造血干細(xì)胞,且這群造血干細(xì)胞的發(fā)生幾乎與AGM來(lái)源同步。在胚胎階段除了AGM區(qū)的生血內(nèi)皮細(xì)胞外,其他部位的胚胎細(xì)胞能夠重建成體小鼠的造血系統(tǒng),這促使科研工作者懷疑在胚胎發(fā)育的特定時(shí)間段是否還存在著其他的原位產(chǎn)生造血干細(xì)胞的器官或組織。在對(duì)造血干細(xì)胞的發(fā)生過(guò)程和調(diào)控機(jī)制的認(rèn)知中,斑馬魚(yú)扮演了不可替代的重要角色。通過(guò)對(duì)斑馬魚(yú)活體實(shí)時(shí)成像研究者直接證實(shí)了造血干細(xì)胞通過(guò)內(nèi)皮-造血轉(zhuǎn)化過(guò)程的方式源于背側(cè)主動(dòng)脈(DA)腹側(cè)壁的生血內(nèi)皮細(xì)胞,后會(huì)進(jìn)一步遷移到后部血島組織(caudal hematopoietic tissue,CHT)進(jìn)行增殖和分化,最終這些造血干細(xì)胞會(huì)遷移到胸腺和腎臟(與高等動(dòng)物的骨髓功能類(lèi)似),為整個(gè)斑馬魚(yú)一生血液系統(tǒng)的維持提供著源源不斷的支持。CHT的功能和小鼠的胎肝相似,造血干細(xì)胞遷移到CHT后與微環(huán)境的各組成細(xì)胞之間相互作用的動(dòng)態(tài)過(guò)程,是造血干細(xì)胞進(jìn)一步增殖和分化的區(qū)域。但是CHT是否可以原位產(chǎn)生造血干細(xì)胞是從沒(méi)有被研究的全新課題。本課題首先通過(guò)活體實(shí)時(shí)成像,發(fā)現(xiàn)在斑馬魚(yú)CHT的尾部主動(dòng)脈(caudal dorsal artery,CDA)腹側(cè)壁一些kdrl-EGFP+細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)DA區(qū)類(lèi)似的EHT過(guò)程,這些細(xì)胞最終會(huì)被標(biāo)記HSPCs的CD41-GFP、cmyb-GFP和runx1-GFP所標(biāo)記,偶爾可以觀察到kdrl-EGFP+細(xì)胞出芽后會(huì)分裂。我們利用共聚焦405激發(fā)波長(zhǎng)對(duì)轉(zhuǎn)基因品系Tg(kdrl:Dendra2)進(jìn)行光轉(zhuǎn)化,標(biāo)記部分尾部動(dòng)脈腹側(cè)壁,之后可看到造血區(qū)域如CHT,胸腺和腎臟都存在被標(biāo)記的細(xì)胞。對(duì)12個(gè)胚胎斑馬魚(yú)CDA進(jìn)行活體實(shí)時(shí)成像觀察,其中大約在DA的EHT過(guò)程之后60 hpf(hours post fertilization)左右,CDA與尾部靜脈分開(kāi),CHT的EHT過(guò)程開(kāi)始,一直持續(xù)到156 hpf。CDA大部分的EHT過(guò)程發(fā)生在60 hpf-84 hpf,隨時(shí)間的推移,EHT頻率慢慢下降。不同時(shí)間段60-84,84-108,108-132,132-156和156-180 hpf EHT的頻率(不同時(shí)間段四個(gè)體節(jié)的出芽頻率)分別是5.60±0.68,3.40±0.81,1.50±0.40,0.80±0.58和0.0±0.0。在統(tǒng)計(jì)的15小時(shí)中,每四個(gè)體節(jié)CDA出芽頻率(3.57±0.57)低于DA出芽頻率(5.86±0.26)。因此,CDA在時(shí)空上獨(dú)立于DA,通過(guò)EHT過(guò)程產(chǎn)生HSPCs。為了進(jìn)一步探索CDA產(chǎn)生的HSPCs,我們利用Tg(CD41:GFP;coro1a:Ds Red),Tg(kdrl:mem Cherry;coro1a:Kaede)追蹤DA和CDA剛產(chǎn)生的HSPCs的行為特征。剛產(chǎn)生的細(xì)胞中含有coro1a-Ds Red信號(hào)和CD41-GFP弱信號(hào),并且coro1a-Kaede信號(hào)也在剛出芽的kdrl-mem Cherry+細(xì)胞中表達(dá),這說(shuō)明我們可以用coro1a-Kaede光轉(zhuǎn)化來(lái)標(biāo)記DA和CDA剛產(chǎn)生的HSPCs。結(jié)果顯示,CDA出芽產(chǎn)生的coro1a-Kaede細(xì)胞大約30%-40%很快分裂成兩個(gè)子細(xì)胞,12小時(shí)內(nèi)會(huì)進(jìn)行第二次分裂,隨后一些細(xì)胞會(huì)進(jìn)入血管和血液循環(huán),另一部分細(xì)胞會(huì)保持原位置進(jìn)行第三次分裂。其中,偶爾能觀察到一些細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)后會(huì)再次進(jìn)入CHT微環(huán)境。CDA產(chǎn)生的細(xì)胞在細(xì)胞行為學(xué)上很像HSPCs的行為,形態(tài)上成球形分裂成前體細(xì)胞,體積分裂后會(huì)變小。相比之下,CDA產(chǎn)生的coro1a-Kaede+細(xì)胞一大半經(jīng)過(guò)一次分裂會(huì)產(chǎn)生髓樣的前體細(xì)胞,細(xì)胞形態(tài)呈變形蟲(chóng)形態(tài)而且變大。經(jīng)過(guò)10個(gè)小時(shí),這些髓樣前體細(xì)胞會(huì)分裂成3-4個(gè)子細(xì)胞,遷移到CHT微環(huán)境中呈現(xiàn)分支裝表型,一些細(xì)胞會(huì)隨血管遷出CHT并遷移至皮膚,呈現(xiàn)典型的髓系細(xì)胞的行為。大約有2%-5%被標(biāo)記的細(xì)胞在出芽時(shí)會(huì)破碎死掉。通過(guò)光轉(zhuǎn)化標(biāo)記DA和CDA出芽的coro1a-Kaede+細(xì)胞,經(jīng)過(guò)60小時(shí)的追蹤,這些細(xì)胞行為學(xué)的追蹤表明CDA產(chǎn)生的HSPCs存在著異質(zhì)性。由于DA和CDA產(chǎn)生的HSPCs在時(shí)空上和遷移傾向上有所不同,我們探討其中潛在的調(diào)控分子。Runx1對(duì)于DA的EHT過(guò)程來(lái)說(shuō)是必不可少的轉(zhuǎn)錄因子,那Runx1是如何影響CDA區(qū)的EHT過(guò)程的呢?我們利用斑馬魚(yú)突變體runx1w84x/w84xTg(kdrl:EGFP),發(fā)現(xiàn)CDA無(wú)法完成EHT過(guò)程,有些細(xì)胞會(huì)有出芽的趨勢(shì),但是最后都收縮回去。這說(shuō)明CDA和DA一樣,EHT過(guò)程都需要轉(zhuǎn)錄因此Runx1來(lái)調(diào)控。在造血過(guò)程中,血流對(duì)血管剪切應(yīng)力促進(jìn)了造血干細(xì)胞的產(chǎn)生。我們利用無(wú)血流的tnnt2aswu77斑馬魚(yú)突變體,發(fā)現(xiàn)CDA的EHT過(guò)程被抑制,而且大部分HSPCs向CDA血管內(nèi)側(cè)出芽,而DA向腹側(cè)出芽產(chǎn)生的HSPCs。上述結(jié)果表明,從DA到CDA連續(xù)發(fā)生的EHT過(guò)程,為整個(gè)動(dòng)脈都有造血能力提供了證據(jù)。為了進(jìn)一步探究動(dòng)脈不同時(shí)間段對(duì)成體斑馬魚(yú)造血的貢獻(xiàn)情況,我們利用Tg(kdrl:Cre ERT2;actb2:lox P-Ds Red-stop-lox P-EGFP)s928轉(zhuǎn)基因系統(tǒng),在五個(gè)時(shí)間點(diǎn)20 hpf,60 hpf,72 hpf,120 hpf和9 dpf(days post fertilization)對(duì)斑馬魚(yú)胚胎進(jìn)行4-OHT(4-Hydroxytamoxifen)處理,并檢測(cè)出4-OHT只誘導(dǎo)血管及血液細(xì)胞Cre重組酶活性。對(duì)4個(gè)月零后的成年斑馬魚(yú)的不同組織區(qū)域進(jìn)行切片免疫熒光染色。利用GFP和Lcp1兩個(gè)抗體共同標(biāo)記出早期胚胎來(lái)源的造血細(xì)胞,20 hpf處理組中,成年斑馬魚(yú)造血組織中GFP陽(yáng)性細(xì)胞占Lcp1+細(xì)胞的比例最高,腎臟中占比76%,胸腺中占比89%,隨著處理時(shí)間的推移,GFP+Lcp1+細(xì)胞比例下降。相比于20 hpf處理組,60 hpf處理組中GFP+Lcp1+細(xì)胞在胸腺比例下降的幅度要比腎臟中的輕微一些,這暗示著這一時(shí)段動(dòng)脈造血對(duì)成年胸腺淋巴細(xì)胞貢獻(xiàn)較大。與此同時(shí),大多數(shù)成年斑馬魚(yú)中腦部小膠質(zhì)細(xì)胞由kdrl+細(xì)胞分化而來(lái),這支持了定向造血來(lái)源地小膠質(zhì)細(xì)胞的觀點(diǎn)。之后,我們?cè)赥g(kdrl:Cre ERT2;coro1a:lox P-Ds Redx-stop-lox P-GFP)s928轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)里用了相同處理方法,得出了上述相似的結(jié)論。因此,隨著時(shí)間的推移,kdrl+動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)EHT過(guò)程對(duì)成年造血譜系的貢獻(xiàn)能力逐漸減弱。根據(jù)我們的研究表明,在斑馬魚(yú)中位于CHT區(qū)的CDA作為新發(fā)現(xiàn)的造血位點(diǎn),與AGM區(qū)的DA類(lèi)似,具有通過(guò)EHT過(guò)程產(chǎn)生HSPCs的能力,并且產(chǎn)生的HSPCs遷移至不同造血組織器官。我們的發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展了斑馬魚(yú)造血發(fā)育過(guò)程的理論研究。
【圖文】：

圖 1.1 斑馬魚(yú)作為模式生物的優(yōu)勢(shì)[18]。斑馬魚(yú)是現(xiàn)存物種中 種理想的模式生物。像果蠅 樣，斑馬魚(yú)胚胎透明而且胚胎產(chǎn)量大，可以用于快速的篩選工作和實(shí)驗(yàn)操作。斑馬魚(yú)和老鼠 樣，具有脊椎動(dòng)物相應(yīng)的解剖學(xué)、生理學(xué)和腫瘤生物學(xué)。Figure 1.1 Strengths of the zebrafish system[18]. The zebrafish is an ideal complement to existinggenetic systems. Like flies, the transparent embryos are produced in large numbers and are accessible for rapidscreening and experimental manipulation. Like mice, zebrafish have vertebrate anatomy, physiology, and tumorbiology.1.2 脊椎動(dòng)物造血系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程在胚胎造血的研究過(guò)程中，研究者經(jīng)過(guò)了數(shù)十年的努力使用了多種不同的模式生物，其中包括雞類(lèi)、兩棲類(lèi)、魚(yú)類(lèi)以及哺乳類(lèi)[19, 20]。脊椎動(dòng)物的整個(gè)造血過(guò)程盡管存在 些差異，但在 定程度上是保守的。這些研究促使研究者歸納了脊椎動(dòng)物胚胎造血作用的的過(guò)程。在所有脊椎動(dòng)物中，具有完整血液譜系的建立都是在原始造血（primitive hematopoiesis） 和定向造血（definitive hematopoiesis）發(fā)育過(guò)程中進(jìn)行的，這些造血過(guò)程發(fā)生在不同的解剖位置[21]。在非洲爪蟾血液

西南大學(xué)博士學(xué)位論文細(xì)胞出現(xiàn)在腹側(cè)血島（ventral blood islands, VBIs），而定向造血來(lái)源于背側(cè)中胚層（dorsal lateral plate mesoderm, DLP mesoderm）[22]。在哺乳動(dòng)物中，原始造血主要發(fā)生在胚胎外卵黃囊中,細(xì)胞會(huì)分化成原始紅細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[23]。在發(fā)育的后期，永久造血在主動(dòng)脈-性腺-中腎（aorta-gonad-mesonephros, AGM）產(chǎn)生多潛能的造血干細(xì)胞，可以分化成各個(gè)血液譜系，之后遷入胎肝進(jìn)行增殖，，而在成體最終造血發(fā)生在骨髓中[24]。（圖 1.2）。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q462

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 張雨;在斑馬魚(yú)中運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行基因敲除及對(duì)斑馬魚(yú)第二波永久造血作用之初探[D];西南大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2702563