【摘要】：大豆是世界第四大作物,是重要的經(jīng)濟作物,在農(nóng)業(yè)中占有重要地位。大豆是農(nóng)作物中蛋白質(zhì)含量最高的作物,蛋白質(zhì)含量高達35%-40%;大豆作為優(yōu)質(zhì)的食用油,出油率在18%-20%,是人類蛋白質(zhì)和食用油的重要來源。除此之外,大豆還可以作為飼料,工業(yè)產(chǎn)品的原材料;大豆種子還可以加工成多種食物產(chǎn)品,如沖調(diào)飲用蛋白制品和添加劑用蛋白制品等。大豆產(chǎn)量需求的持續(xù)增加,迫使需要優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆性強的大豆品種。利用CRISPR-Cas9可以快速高效的實現(xiàn)大豆品種的改良。在CRISPR-Cas9系統(tǒng)中,U6啟動子常被用于驅(qū)動sgRNA的轉(zhuǎn)錄,是CRISPR-Cas9系統(tǒng)中重要的元件。適用于大豆且能夠高效轉(zhuǎn)錄的大豆U6啟動子尚未報道,而親緣關(guān)系較遠的物種間的U6啟動子不一定適用。因此本研究的目的:篩選具有較高轉(zhuǎn)錄活性和編輯效率的大豆U6啟動子。方法:本研究克隆了大豆11個U6啟動子,通過驅(qū)動GUS基因的表達對大豆U6啟動子在大豆發(fā)狀根和擬南芥中的轉(zhuǎn)錄活性進行了分析。同時選取4個大豆基因作為基因編輯的目的基因,誘導大豆形成發(fā)狀根,通過DNA聚合酶鏈式反應和限制性內(nèi)切酶酶切(RE-PCR)檢測大豆目的基因的突變效率,篩選出具有最高效編輯效率的大豆U6啟動子,可以用于敲除或沉默大豆相關(guān)功能基因,從而獲得營養(yǎng)豐富或優(yōu)質(zhì)的大豆,為CRISPR-Cas9系統(tǒng)在大豆分子育種中的應用提供基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1.在大豆全基因組水平上克隆了11個GmU6啟動子,片段大小分別為352bp,256 bp,342 bp,236 bp,342 bp,257 bp,279 bp,314 bp,280 bp,306 bp,294 bp�；�11個GmU6啟動子構(gòu)建了p3301-GUS-GmU6-1~p3301-GUS-GmU6-11真核表達載體,并用于植物轉(zhuǎn)化。2.本研究通過農(nóng)桿菌K599介導的轉(zhuǎn)化大豆發(fā)狀根和農(nóng)桿菌GV3101轉(zhuǎn)化擬南芥,系統(tǒng)地分析和比較了11個GmU6啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn),在大豆發(fā)狀根中GmU6-1,GmU6-4,GmU6-7,GmU6-8,GmU6-10和GmU6-11啟動子的轉(zhuǎn)錄水平都明顯高于GmU6-5啟動子;而在擬南芥中GmU6-2,GmU6-3,GmU6-4,GmU6-7,GmU6-8,GmU6-10和GmU6-11轉(zhuǎn)錄活性都高于GmU6-5啟動子。綜合11個U6啟動子在豆子發(fā)狀根和擬南芥葉片中的相對表達水平來看,GmU6-4,GmU6-7,GmU6-8,GmU6-10和GmU6-11啟動子轉(zhuǎn)錄活性相對較高。3.本研究中,我們選取了大豆四個基因作為基因編輯的靶基因,并且為每個基因分別設計了對應的sgRNA。最終構(gòu)建了Glyma06g14180-pCas9-GmU6-1~Glyma06g14180-pCas9-GmU6-11,Glyma03g36470-pCas9-GmU6-1~Glyma03g36470-pCas9-GmU6-11,Glyma11g253000-pCas9-GmU6-1~Glyma11g253000-pCas9-GmU6-11,Glyma14g04180-pCas9-GmU6-1~Glyma14g04180-pCas9-GmU6-11,共44個載體,并用作大豆發(fā)狀根的轉(zhuǎn)化。4.通過PCR-RE方法檢測44個載體轉(zhuǎn)化的大豆發(fā)狀根的突變情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)11個GmU6啟動子在不同的基因中發(fā)生的突變類型是不一樣的,Glyma03g36470、Glyma14g04180和Glyma11g253000涉及的突變類型主要是堿基的缺失,而Glyma06g14180的突變類型大多數(shù)是堿基插入和缺失。GmU6-8和GmU6-10啟動子在Glyma06g14180,Glyma03g36470,Glyma14g04180三個基因中的編輯效率分別為22.1%,26.6%,12.1%;20.5%,14.7%,15.9%。結(jié)合11個GmU6啟動子在大豆發(fā)狀根和擬南芥中的轉(zhuǎn)錄活性,我們發(fā)現(xiàn)GmU6-8和GmU6-10啟動子在CRISPR-Cas9系統(tǒng)中的基因編輯效率相對較高(平均突變率分別為20.3%和20.6%)。
【圖文】：

圖 1-2 CRISPR-Cas9 原理[49]Fig. 1-2 The theory of CRISPR-Cas9 CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)在植物基因功能中的研究進.基因敲除前，CRISPR-Cas9 系統(tǒng)最主要應用于包括植物在內(nèi)的多種生物的且可以同時針對多個靶基因。例如，朱健康[50]研究小組使用 CRISP重基因編輯，創(chuàng)建一個 PYL/PYR 六元組突變體，使用一個包含六 表達盒的結(jié)構(gòu)，它為快速創(chuàng)建多個基因敲除提供了強大的工具，余問題。在小麥中，Zhang[51]等靶向 GASR7 基因增加小麥的千粒[52]在黃瓜中靶向 eIF4E 基因，提高了黃瓜的病毒抗性。還有研究[53 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)定點敲除 ZmTMS5 基因，所有 T0 代植株都進的修飾，并且 tms5 突變體穩(wěn)定傳遞到下一代，產(chǎn)生溫敏雄性不育.目標基因替換/插入

11圖 1-3 技術(shù)路線Fig. 1-3 Technical route1.8 研究目的及意義大豆富含蛋白質(zhì)和油脂，是我們?nèi)祟愔参镄偷鞍缀褪秤糜偷闹匾獊碓矗谖覈鴩裆攀丑w系中發(fā)揮著重要的功能。大豆種子能加工成多種食物，如豆?jié){，豆腐，豆奶等；同時它還含有眾多有益于人體健康的活性成分，如異黃酮，維生素E，皂甙，磷脂等，是重要的油料作物。大豆在食品中應用的廣泛性以及大豆產(chǎn)量增加的需求，促使我們培育優(yōu)良高產(chǎn)以及抵抗外界環(huán)境脅迫能力的大豆。利用CRISPR-Cas9 可以改良大豆，在 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)中，U6 RNA 對應的 U6 啟動子常被用于驅(qū)動 sgRNA 的轉(zhuǎn)錄，是 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)中重要的元件[104]，但親緣關(guān)系較遠的物種間的 U6 啟動子并不一定適用，且適用于大豆并高效轉(zhuǎn)錄的自
【學位授予單位】：河北工程大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S565.1;Q943.2

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本文編號：2698289