發(fā)布時(shí)間：2020-06-03 20:22

【摘要】：RsmA(Repressor of secondary metabolism A,次生代謝抑制蛋白),在有些細(xì)菌中也叫CsrA(Carbon storage regulator A,碳儲(chǔ)存調(diào)控蛋白),廣泛存在于各種細(xì)菌中,作為全局轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子在中心碳代謝、糖異生、糖原合成、生物被膜形成、鞭毛產(chǎn)生、群體感應(yīng)和致病等生理過程中發(fā)揮非常重要的調(diào)控作用。我們課題組之前的研究發(fā)現(xiàn),在十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestrispv.campestris,Xcc)4中,RsmA作為全局轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子在致病、HR反應(yīng)、胞外多糖產(chǎn)生、胞外酶活性、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)以及生物膜形成等多個(gè)生理過程中起重要作用,但作用機(jī)制尚未完全清楚。RsmA是一個(gè)典型的RNA結(jié)合蛋白,長期以來,人們普遍認(rèn)為RsmA只能通過與靶標(biāo)mRNA的結(jié)合來行使其調(diào)控功能。但是,最近的研究發(fā)現(xiàn),RsmA也能夠通過與其它蛋白的結(jié)合來發(fā)揮作用。我們猜測,在Xcc中,RsmA可能也會(huì)通過蛋白-蛋白互作來發(fā)揮作用�；谶@個(gè)推測,本研究擬通過交聯(lián)和免疫共沉淀技術(shù),在全基因組水平上鑒定Xcc細(xì)胞中與RsmA結(jié)合的蛋白。為了鑒定Xcc細(xì)胞中所有與RsmA結(jié)合(包括瞬間結(jié)合和弱結(jié)合)的蛋白,我們在豐富培養(yǎng)基NYGB中分別培養(yǎng)表達(dá)RsmA-3F蛋白(RsmA蛋白C端帶有3×Flag抗原標(biāo)簽)的菌株,即2506-3F,以及對照菌株Xcc8004(表達(dá)不帶任何抗原標(biāo)簽的RsmA蛋白),菌體經(jīng)紫外交聯(lián)(使得RsmA與其靶蛋白發(fā)生共價(jià)結(jié)合)后進(jìn)行總蛋白提取,接著用3×Flag磁珠將‘RsmA-蛋白復(fù)合體'從總蛋白中共沉淀出來,最后通過質(zhì)譜分析來確定沉淀出來的'RsmA-蛋白復(fù)合體'中包含的蛋白種類,從而發(fā)現(xiàn)與RsmA結(jié)合的蛋白。結(jié)果顯示,從2506-3F菌株中獲得的'RsmA-蛋白復(fù)合體'中有76種蛋白,而從對照菌株Xcc8004中獲得的'RsmA-蛋白復(fù)合體'中只有16種。經(jīng)過比較分析,我們確定了 48個(gè)蛋白作為與RsmA結(jié)合的候選蛋白。有意思的是,在這48個(gè)候選蛋白中,有19個(gè)蛋白是Xcc中心碳代謝途徑中的酶,預(yù)示RsmA可以通過蛋白-蛋白互作來調(diào)控中心碳代謝。為了明確這48個(gè)候選蛋白是否真的與RsmA結(jié)合,我們采用細(xì)菌雙雜交技術(shù)對部分候選蛋白與RsmA的互作進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果證明了一個(gè)強(qiáng)互作的蛋白ProA(XC1880)以及7個(gè)弱的互作蛋白[Conserved hypothetical protein(XC0932)、PpsA(XC1952)、RpfA(XC2329)、RpoA(XC3316)、RpsG(XC3344)、RpoB(XC3347)和RplA(XC3350)]。為了進(jìn)一步確認(rèn)這些在細(xì)菌雙雜交實(shí)驗(yàn)中顯示為陽性的蛋白是否真的與RsmA直接結(jié)合,我們采用了交互免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)行再次驗(yàn)證。結(jié)果證明,ProA蛋白確實(shí)能夠與RsmA直接結(jié)合。本研究證明了Xc 的RsmA能夠與ProA蛋白直接結(jié)合,預(yù)示Xcc中RsmA也能通過與蛋白互作來發(fā)揮其調(diào)控作用。ProA是繼FliW和CesT之后,第三個(gè)發(fā)現(xiàn)的與RsmA結(jié)合的蛋白。我們的研究拓寬了人們對RsmA作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)。
【圖文】：

學(xué)硬士學(xué)位論文邐十字花科黑腐病菌中與全局轉(zhuǎn)錄后調(diào)拉蛋白ＲｓｍＡ結(jié)合的蛋以進(jìn)一步細(xì)分成弱瞬時(shí)復(fù)合物和強(qiáng)瞬時(shí)復(fù)合物［８４］：弱瞬時(shí)復(fù)合物在體內(nèi)表現(xiàn)物的動(dòng)態(tài)混合，而強(qiáng)瞬時(shí)復(fù)合物只有在被觸發(fā)的情況下才改變其四聚體狀態(tài)，體的結(jié)合職］。弱瞬時(shí)相互作用的解離常數(shù)（ＫＤ）在微摩爾范圍，周期是秒相互作用，因?yàn)橛行?yīng)物分子的穩(wěn)定作用，，所以持續(xù)的時(shí)間會(huì)更長，并且有解離常數(shù)（ＫＤ）邋［８５］，在納米摩爾范圍（蛋白質(zhì)互作的結(jié)合力強(qiáng)弱通常與解比關(guān)系）［８３１。這一類型的互作包括由效應(yīng)分子或構(gòu)象變化觸發(fā)或穩(wěn)定的蛋白。Ｒａｓ蛋白就是一個(gè)例子，當(dāng)與ＧＴＰ結(jié)合時(shí)，其能與伴侶形成緊密的復(fù)合物；結(jié)合時(shí)卻只能形成弱的復(fù)合物＠１。蛋白質(zhì)作用力強(qiáng)弱及分類可用下圖來總結(jié)

圖１－２細(xì)菌雙雜交的原理【１Ｑ７］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｂａｃｔｅｒｉａｌ邋ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ邋ｓｔｒａｔｅｇｙ逡逑雙雜交系統(tǒng)包括了三個(gè)部分，ｐＢＴ質(zhì)粒、ｐＴＲＧ質(zhì)粒和ＸＬｌ－ＢｌｕｅＭＲＦ＇Ｋａｎ邋ｓｔ的片段導(dǎo)入ｐＢＴ質(zhì)粒中，把靶標(biāo)基因片段導(dǎo)入ｐＴＲＧ質(zhì)粒中，質(zhì)粒構(gòu)建成功中。當(dāng)￥Ｅ標(biāo)質(zhì)粒和誘館質(zhì)粒能夠互作，那么就會(huì)連接起來，使得Ｘｃｌ（Ｘ邋ｏｐｅｒａｔｏ上的／／７Ｓ３邋（編碼的產(chǎn)物是３－ＡＴ的拮抗物）和ａａ以（鏈霉素抗性）基因。／／Ｚ后表現(xiàn)為報(bào)告菌株能夠在含有３－ＡＴ和鏈霉素抗性的雙重篩選平板上正常生長花科黑腐病菌的致病機(jī)理研究進(jìn)展逡逑
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q933

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 施蘊(yùn)渝;吳季輝;;應(yīng)用核磁共振波譜技術(shù)研究蛋白質(zhì)相互作用[J];科學(xué)通報(bào);2009年08期

2 任仙文;李北平;王月蘭;岳俊杰;梁龍;;蛋白質(zhì)相互作用的生物信息學(xué)研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通訊;2006年06期

3 李建華;陳利玉;;細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)及其在病原微生物學(xué)中的應(yīng)用[J];微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展;2006年03期

本文編號：2695346