發(fā)布時間：2020-06-03 20:22

【摘要】：RsmA(Repressor of secondary metabolism A,次生代謝抑制蛋白),在有些細菌中也叫CsrA(Carbon storage regulator A,碳儲存調(diào)控蛋白),廣泛存在于各種細菌中,作為全局轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子在中心碳代謝、糖異生、糖原合成、生物被膜形成、鞭毛產(chǎn)生、群體感應和致病等生理過程中發(fā)揮非常重要的調(diào)控作用。我們課題組之前的研究發(fā)現(xiàn),在十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestrispv.campestris,Xcc)4中,RsmA作為全局轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子在致病、HR反應、胞外多糖產(chǎn)生、胞外酶活性、細胞運動以及生物膜形成等多個生理過程中起重要作用,但作用機制尚未完全清楚。RsmA是一個典型的RNA結(jié)合蛋白,長期以來,人們普遍認為RsmA只能通過與靶標mRNA的結(jié)合來行使其調(diào)控功能。但是,最近的研究發(fā)現(xiàn),RsmA也能夠通過與其它蛋白的結(jié)合來發(fā)揮作用。我們猜測,在Xcc中,RsmA可能也會通過蛋白-蛋白互作來發(fā)揮作用�；谶@個推測,本研究擬通過交聯(lián)和免疫共沉淀技術,在全基因組水平上鑒定Xcc細胞中與RsmA結(jié)合的蛋白。為了鑒定Xcc細胞中所有與RsmA結(jié)合(包括瞬間結(jié)合和弱結(jié)合)的蛋白,我們在豐富培養(yǎng)基NYGB中分別培養(yǎng)表達RsmA-3F蛋白(RsmA蛋白C端帶有3×Flag抗原標簽)的菌株,即2506-3F,以及對照菌株Xcc8004(表達不帶任何抗原標簽的RsmA蛋白),菌體經(jīng)紫外交聯(lián)(使得RsmA與其靶蛋白發(fā)生共價結(jié)合)后進行總蛋白提取,接著用3×Flag磁珠將‘RsmA-蛋白復合體'從總蛋白中共沉淀出來,最后通過質(zhì)譜分析來確定沉淀出來的'RsmA-蛋白復合體'中包含的蛋白種類,從而發(fā)現(xiàn)與RsmA結(jié)合的蛋白。結(jié)果顯示,從2506-3F菌株中獲得的'RsmA-蛋白復合體'中有76種蛋白,而從對照菌株Xcc8004中獲得的'RsmA-蛋白復合體'中只有16種。經(jīng)過比較分析,我們確定了 48個蛋白作為與RsmA結(jié)合的候選蛋白。有意思的是,在這48個候選蛋白中,有19個蛋白是Xcc中心碳代謝途徑中的酶,預示RsmA可以通過蛋白-蛋白互作來調(diào)控中心碳代謝。為了明確這48個候選蛋白是否真的與RsmA結(jié)合,我們采用細菌雙雜交技術對部分候選蛋白與RsmA的互作進行了驗證。結(jié)果證明了一個強互作的蛋白ProA(XC1880)以及7個弱的互作蛋白[Conserved hypothetical protein(XC0932)、PpsA(XC1952)、RpfA(XC2329)、RpoA(XC3316)、RpsG(XC3344)、RpoB(XC3347)和RplA(XC3350)]。為了進一步確認這些在細菌雙雜交實驗中顯示為陽性的蛋白是否真的與RsmA直接結(jié)合,我們采用了交互免疫共沉淀技術進行再次驗證。結(jié)果證明,ProA蛋白確實能夠與RsmA直接結(jié)合。本研究證明了Xc 的RsmA能夠與ProA蛋白直接結(jié)合,預示Xcc中RsmA也能通過與蛋白互作來發(fā)揮其調(diào)控作用。ProA是繼FliW和CesT之后,第三個發(fā)現(xiàn)的與RsmA結(jié)合的蛋白。我們的研究拓寬了人們對RsmA作用機制的認識。
【圖文】：

學硬士學位論文邐十字花科黑腐病菌中與全局轉(zhuǎn)錄后調(diào)拉蛋白ＲｓｍＡ結(jié)合的蛋以進一步細分成弱瞬時復合物和強瞬時復合物［８４］：弱瞬時復合物在體內(nèi)表現(xiàn)物的動態(tài)混合，而強瞬時復合物只有在被觸發(fā)的情況下才改變其四聚體狀態(tài)，體的結(jié)合職］。弱瞬時相互作用的解離常數(shù)（ＫＤ）在微摩爾范圍，周期是秒相互作用，因為有效應物分子的穩(wěn)定作用，，所以持續(xù)的時間會更長，并且有解離常數(shù)（ＫＤ）邋［８５］，在納米摩爾范圍（蛋白質(zhì)互作的結(jié)合力強弱通常與解比關系）［８３１。這一類型的互作包括由效應分子或構象變化觸發(fā)或穩(wěn)定的蛋白。Ｒａｓ蛋白就是一個例子，當與ＧＴＰ結(jié)合時，其能與伴侶形成緊密的復合物；結(jié)合時卻只能形成弱的復合物＠１。蛋白質(zhì)作用力強弱及分類可用下圖來總結(jié)

圖１－２細菌雙雜交的原理【１Ｑ７］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｂａｃｔｅｒｉａｌ邋ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ邋ｓｔｒａｔｅｇｙ逡逑雙雜交系統(tǒng)包括了三個部分，ｐＢＴ質(zhì)粒、ｐＴＲＧ質(zhì)粒和ＸＬｌ－ＢｌｕｅＭＲＦ＇Ｋａｎ邋ｓｔ的片段導入ｐＢＴ質(zhì)粒中，把靶標基因片段導入ｐＴＲＧ質(zhì)粒中，質(zhì)粒構建成功中。當￥Ｅ標質(zhì)粒和誘館質(zhì)粒能夠互作，那么就會連接起來，使得Ｘｃｌ（Ｘ邋ｏｐｅｒａｔｏ上的／／７Ｓ３邋（編碼的產(chǎn)物是３－ＡＴ的拮抗物）和ａａ以（鏈霉素抗性）基因。／／Ｚ后表現(xiàn)為報告菌株能夠在含有３－ＡＴ和鏈霉素抗性的雙重篩選平板上正常生長花科黑腐病菌的致病機理研究進展逡逑
【學位授予單位】：廣西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q933

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 施蘊渝;吳季輝;;應用核磁共振波譜技術研究蛋白質(zhì)相互作用[J];科學通報;2009年08期

2 任仙文;李北平;王月蘭;岳俊杰;梁龍;;蛋白質(zhì)相互作用的生物信息學研究進展[J];生物技術通訊;2006年06期

3 李建華;陳利玉;;細菌雙雜交系統(tǒng)及其在病原微生物學中的應用[J];微生物學免疫學進展;2006年03期

本文編號：2695346