【摘要】：背景木聚糖酶(Xylanase)[EC.3.2.1.8]在自然界分布廣泛,是可以將木聚糖降解為低聚木糖和木糖的一組酶。木聚糖酶在釀酒、飼料、造紙、能源等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用,工業(yè)應(yīng)用對木聚糖酶的熱穩(wěn)定性要求較高,但是天然中溫木聚糖酶熱穩(wěn)定性較差,對其分子改造提高熱穩(wěn)定性已成為迫切需要。目的1獲得熱穩(wěn)定性提高的突變酶。2獲得實驗室水平的木聚糖酶基因工程菌最優(yōu)發(fā)酵條件。3探索突變酶在枯草芽孢桿菌和畢赤酵母中的表達差異。方法1木聚糖酶基因生物信息學(xué)分析利用DNAMAN 6.0、NCBI BLAST對木聚糖酶基因xyn ZF-2進行同源序列比對分析,通過The Phyre2、DS ViewerPro 6.0、Prosite、ProScale等軟件對酶分子的空間結(jié)構(gòu)、分子理化性質(zhì)以及分子間作用進行綜合分析,確定酶的改造方案。2突變基因及表達載體構(gòu)建利用重疊延伸PCR,全基因突變等方法獲得目的基因,構(gòu)建突變基因的畢赤酵母和枯草芽孢桿菌表達載體。3突變木聚糖酶誘導(dǎo)表達重組突變酶經(jīng)過誘導(dǎo)發(fā)酵成功在畢赤酵母和枯草芽孢桿菌中表達。4突變酶酶學(xué)性質(zhì)分析對重組工程菌的表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE分析,DNS顯色反應(yīng)測定突變酶的最適溫度、熱穩(wěn)定性、最適pH、pH穩(wěn)定性、評估以上因素對酶活力的影響。5重組工程菌發(fā)酵條件的優(yōu)化通過單因素試驗,對重組工程菌產(chǎn)酶的發(fā)酵培養(yǎng)基、誘導(dǎo)溫度、種齡、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)初始pH、甲醇濃度等多方面發(fā)酵條件進行優(yōu)化,并且結(jié)合正交試驗和響應(yīng)面分析綜合實驗,探索工程菌的最佳發(fā)酵條件。結(jié)果1木聚糖酶XynZF-2 C-端引入二硫鍵,構(gòu)建大腸桿菌重組菌BL21(DE3)/pET-28a-xynZFTA;構(gòu)建畢赤酵母重組菌GS115/pPIC9K-xynZFTA。2將EvXyn11 N-端的34個氨基酸替換木聚糖酶XynZF-2的N-端48個氨基酸,引入芳香族氨基酸P9Y和H14F,糖基化修飾位點E42N和F17S,C-端引入二硫鍵Cys38-Cys191、α-螺旋及cord區(qū)域引入疏水性氨基酸K164M、G166A、N160I及V111A、G109A,最后兩個堿基(AA)替換成(GC),添加pPIC9K多克隆區(qū)域部分序列,設(shè)計雜合酶。獲得工程菌GS115/pPIC9K-xyn ZL+實驗室水平的最佳發(fā)酵條件:誘導(dǎo)溫度29.4℃,誘導(dǎo)時間180 h,誘導(dǎo)初始pH5.5,誘導(dǎo)甲醇濃度1.16%。3 XynZFTA、XynZL+和XynZF-2分子量分別為24.10 kDa、24.60 kDa、24.10 kDa。4成功構(gòu)建枯草芽孢桿菌重組菌WB600/pP43NMK-xynZF-2,表達出木聚糖酶。5 BL21(DE3)作為宿主,XynZFTA的最適溫度比原酶(40℃)提高了10℃,在50℃保溫5 min,突變酶殘余的相對酶活性為55.36%,較原酶(32.62%)提高了22.74%。6 GS115作為宿主,XynZFTA和XynZL+最適溫度分別提高了15℃和5℃,XynZFTA的t_(1/2)~(60℃)=9 min、XynZL+的t_(1/2)~(60℃)=10 min,原酶在此溫度下失活;GS115/pPIC9K-xyn ZFTA、GS115/pPIC9K-xynZL+最適溫度和最適pH分別是60℃、50℃和pH5.0、pH6.0。7 BL21(DE3)/xynZFTA、GS115/xynZFTA和GS115/xynZL+重組酶K_m分別為0.063、4.15和2.52,V_(max)分別為120μmoL/mL/min、350μmoL/mL/min和253μmoL/mL/min。結(jié)論1 C-端引入二硫鍵;多位點突變和修飾(N-端替換,糖基化修飾位點引入和在α-螺旋及cord區(qū)域分別引入疏水性氨基酸)可以提高木聚糖酶分子的熱穩(wěn)定性。2畢赤酵母作為宿主比大腸桿菌和枯草芽孢桿菌更有利于酶改造特性的體現(xiàn)。
【圖文】：

4 2.0 0.4 0.5 2.5 0.6345 2.5 0.5 0 2.5 0.842圖1 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of xylose1.12.2 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制見表15，量取不同體積的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液和蒸餾水加入5組不同的實驗組，使終體積為100 μL，加入考馬斯亮藍染色液5 mL，混合均勻后室溫放置5 min，，搖勻，使用紫外分光光度計測量在595 nm處的吸光值（每組3個平行試驗組，y=2.1111x-0

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文30取平均值），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（圖2）。1.12.3 相關(guān)公式推導(dǎo)酶活力也稱酶活性，即酶催化化學(xué)反應(yīng)的能力。酶活力的大小可以用它在一定條件下催化的某一化學(xué)反應(yīng)的轉(zhuǎn)化速率來表示，即在酶的催化作用下，底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的速率越快，酶的活力就越高，測定酶的活力就是測定酶促轉(zhuǎn)化速率。表15 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制Table 15 Standard curve of protein圖2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of protein酶活力公式由木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線推導(dǎo)得出：試管號 蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（mL） 蛋白含量（mg） 蒸餾水（mL） 考馬斯亮藍（mL） A5950 0 0 0.10 5 01 0.01 0
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q78

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本文編號：2694847