發(fā)布時(shí)間：2020-06-01 22:01

【摘要】：研究背景:哺乳動(dòng)物和人的十二指腸黏膜上皮具有吸收和分泌兩大功能,其分泌粘液和HCO_3~-的能力,對(duì)于保護(hù)脆弱的十二指腸上皮免受胃酸和胃蛋白酶等侵襲因子的損害至關(guān)重要。目前已知囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFTR)和Cl~-/HCO_3~-陰離子交換器(AE)是參與十二指腸黏膜上皮頂端HCO_3~-分泌主要的蛋白。但除了CFTR和AE之外,還發(fā)現(xiàn)腸上皮細(xì)胞表達(dá)能夠介導(dǎo)陰離子分泌的其他幾種Cl~-通道,其中ClC-2通道已經(jīng)證明在腸上皮細(xì)胞的頂端或/和基底外側(cè)膜中表達(dá)。ClC-2通道是一類電壓門控性陰離子通道ClC超家族的成員,在全身廣泛表達(dá),發(fā)揮非常重要的生理作用,在腸道ClC-2通道可介導(dǎo)結(jié)腸Cl~-分泌,其特異性激動(dòng)劑魯比前列酮已經(jīng)作為治療便秘的藥物在臨床廣泛應(yīng)用。到目前為止,ClC-2通道在小腸上皮陰離子分泌中的作用,特別是十二指腸黏膜分泌中的作用和機(jī)制很少被研究。因此我們旨在探討ClC-2通道介導(dǎo)十二指腸黏膜上皮細(xì)胞分泌的作用和分子機(jī)制,并初步探索ClC-2與Ca~(2+)信號(hào)、CFTR與cAMP信號(hào)的相互作用。研究方法:首先,應(yīng)用組織免疫熒光技術(shù)和熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測小鼠十二指腸黏膜中ClC-2蛋白和mRNA的表達(dá)和定位情況;然后通過Ussing Chamber實(shí)驗(yàn)測量小鼠十二指腸黏膜離子分泌功能,分別將6-8周野生型C57小鼠及CFTR~(-/-)小鼠的十二指腸黏膜剝離肌層并安裝在Ussing小室中,藥物刺激后同時(shí)記錄體外十二指腸短路電流(Isc)和HCO_3~-分泌;小鼠體內(nèi)十二指腸黏膜HCO_3~-分泌(DMBS)通過CO_2敏感電極測量,將小鼠十二指腸下段游離結(jié)扎,采用局部灌流和全身靜脈注射給藥兩種方式,收集十二指腸分泌液測量;采用單細(xì)胞數(shù)字Ca~(2+)測定系統(tǒng)檢測十二指腸上皮細(xì)胞系SCBN細(xì)胞中的游離Ca~(2+)([Ca~(2+)]cyt)濃度;通過短路電流(SSC)技術(shù)檢測小鼠十二指腸黏膜的跨上皮電阻(TEER)。研究結(jié)果:1.ClC-2在小鼠十二指腸黏膜有表達(dá),并且定位于基底側(cè)(漿膜側(cè));2.魯比前列酮(lubiprostone,10-1000 nM),一種選擇性ClC-2激動(dòng)劑,僅在小鼠十二指腸漿膜側(cè)給藥時(shí),濃度依賴性地引起Isc增高和HCO_3~-分泌,在黏膜側(cè)(頂側(cè))給藥時(shí)未檢測到Isc和HCO_3~-分泌(p0.01,n=5);3.在組織外液中完全去除Cl~-后,魯比前列酮無論在漿膜側(cè)還是黏膜側(cè)均不能刺激十二指腸Isc增高;但即使存在DIDS(Cl~-/HCO_3~-交換抑制劑)時(shí),也不影響十二指腸HCO_3~-分泌(p0.05,n=6);4.甘氨酰胺(一種CFTR通道阻滯劑)能夠抑制魯比前列酮誘導(dǎo)的十二指腸HCO_3~-分泌(p0.01,n=6);此外,與同窩野生型小鼠相比,魯比前列酮誘導(dǎo)的HCO_3~-分泌在CFTR~(-/-)小鼠中明顯降低(p0.01,n=5);5.魯比前列酮(1μM)在十二指腸腔局部灌注并未改變體內(nèi)基礎(chǔ)DMBS,但魯比前列酮(0.1 mg/kg)腹腔注射能夠誘導(dǎo)DMBS,并且能夠被ClC-2通道阻滯劑Cd~(2+)明顯抑制(p0.01,n=6);6.魯比前列酮激活ClC-2后SCBN細(xì)胞內(nèi)游離Ca~(2+)無明顯變化(p0.05,n=10),抑制Ca~(2+)激活的K~+通道和抑制cAMP信號(hào)通路后魯比前列酮介導(dǎo)的十二指腸Isc和HCO_3~-分泌無明顯抑制(p0.05,n=6);魯比前列酮激活ClC-2后十二指腸黏膜TEER值無明顯變化(p0.05,n=6)。結(jié)論:本研究通過小鼠體內(nèi)外黏膜Isc和HCO_3~-分泌檢測,發(fā)現(xiàn)魯比前列酮可選擇性激活十二指腸上皮漿膜側(cè)ClC-2通道,在十二指腸黏膜的離子分泌中發(fā)揮重要作用。1.小鼠體內(nèi)外十二指腸漿膜側(cè)ClC-2通道激活后,能夠介導(dǎo)黏膜Cl~-及HCO_3~-分泌;2.ClC-2激活后對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)信號(hào)、細(xì)胞間緊密連接及cAMP信號(hào)通路無明顯影響;3.ClC-2介導(dǎo)十二指腸黏膜Cl~-及HCO_3~-分泌需要黏膜側(cè)CFTR參與,可能機(jī)制是漿膜側(cè)ClC-2通道激活為CFTR提供了HCO_3~-。因此,本研究為十二指腸上皮細(xì)胞中ClC-2通道的功能性表達(dá)及其在DMBS調(diào)節(jié)中的新作用提供了證據(jù),為ClC-2在十二指腸潰瘍及黏膜保護(hù)中的深入研究提供了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1-2.免疫熒光檢測 ClC-2 在小鼠十二指腸黏膜的表達(dá)2.3 討 論文獻(xiàn)報(bào)道上皮細(xì)胞系中 ClC-2 表達(dá)在上皮細(xì)胞的頂側(cè)，然而，人、小鼠、豚鼠和大鼠腸道都很清楚的觀察到 ClC-2 定位在結(jié)腸黏膜的基底外側(cè)。目前 ClC-2 在細(xì)胞和膜的定位存在爭議，認(rèn)為 ClC-2 的定位可能取決于物種、組織以及用于定位的方法和使用的ClC-2 抗體[22]。ClC-2 可位于基底外側(cè)膜、頂膜、緊密連接區(qū)或腸上皮細(xì)胞胞質(zhì)中[36-40]例如，使用抗 ClC-2 抗體 ACL-002，pAB-218，H-90 和 YY9 通常顯示 ClC-2 定位在幾個(gè)組織的側(cè)膜，而其他抗體如 ClC21-A、雞抗-ClC-2 和兔抗-ClC-2 顯示 ClC-2 定位在頂膜和緊密連接處。而相同的抗體顯示 ClC-2 的分布是物種依賴的。例如，ClC-002 抗體顯示 ClC-2 定位在小鼠結(jié)腸中的基底側(cè)，，而分布在人體結(jié)腸的細(xì)胞質(zhì)中。而 ClC-2 在小鼠十二指腸黏膜的表達(dá)與定位已有文獻(xiàn)報(bào)道，Pena-Munzenmayer 采用免疫熒光技術(shù)比較 ClC-2 在小鼠十二指腸與結(jié)腸黏膜的定位，發(fā)現(xiàn) ClC-2 表達(dá)在小鼠結(jié)腸黏膜頂側(cè)，而

表二 魯比前列酮刺激小鼠十二指腸黏膜 HCO3-分泌No Titrant used: 0.5 mM HCl date: 06/12/17Stimulant: RU-0211 comments:Ring Area: 0.1 cm2 Patient namCe: 57 Surg timevolt clamp: mV SEX: M Mount time.No: Time PD Isc pH HCl titr Isc net HCl G (condt) Isc R HCO3 Comments(min) (mV) (mA) (ml) (mA/cm2) (ml) (msiem/cm2) (mEq/cm2-h)(W·cm2) (mmol/cm2 -h)0 1.2 3.06 7.087 0 38.25 0.00 25.50 1.78 31.37 0.00 EP1 5 1.2 3.13 7.084 0.027 39.13 27.00 26.08 1.82 30.67 2.032 10 1.1 2.98 7.091 0.045 37.25 18.00 27.09 1.74 29.53 1.353 15 1 2.95 7.081 0.07 36.88 25.00 29.50 1.72 27.12 1.884 20 1.1 2.99 7.089 0.1 37.38 30.00 27.18 1.74 29.43 2.255 25 1 2.88 7.092 0.121 36.00 21.00 28.80 1.68 27.78 1.586 30 0.9 2.53 7.09 0.152 31.63 31.00 28.11 1.47 28.46 2.33 RU 10-47 35 2.5 7.36 7.083 0.179 92.00 27.00 29.44 4.29 27.17 2.03 100nM8 40 2.6 8.09 7.084 0.211 101.13 32.00 31.12 4.71 25.71 2.409 45 2.3 7.14 7.085 0.248 89.25 37.00 31.04 4.16 25.77 2.7810 50 2.4 7.56 7.089 0.282 94.50 34.00 31.50 4.41 25.40 2.5511 55 2.2 7.08 7.088 0.316 88.50 34.00 32.18 4.13 24.86 2.5512 60 2.3 7.5 7.092 0.351 93.75 35.00 32.61 4.37 24.53 2.6313 65 2 6.83 7.081 0.392 85.38 41.00 34.15 3.98 23.43 3.0814 70 1.8 6.3 7.084 0.43 78.75 38.00 35.00 3.67 22.86 2.8515 75 1.7 5.97 7.092 0.463 74.63 33.00 35.12 3.48 22.78 2.4816 80 3.6 5.98 7.087 0.509 74.75 46.00 16.61 3.49 48.16 3.4517 85 1.7 6.03 7.081 0.552 75.38 43.00 35.47 3.51 22.55 3.2318 90 1.7 6.31 7.088 0.
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R333

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2 張佳琪;王鳳云;謝t熞

本文編號(hào)：2692130