【摘要】：IRF7(Interferon regulate factor 7)是激活I(lǐng)型IFN基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)過程中起著關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用的IRFs家族成員,它參與機(jī)體的天然免疫和獲得性免疫調(diào)控。在病原體入侵宿主時(shí),宿主模式識別受體與病原相關(guān)分子模式相互作用,激活宿主不同的信號通路,磷酸化激活I(lǐng)RF7,使其從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)并結(jié)合IFN的啟動(dòng)子,激活且釋放IFN分子,隨后JAK/STAT信號通路被激活,產(chǎn)生許多具有發(fā)揮抗病毒功能的ISGs,從而抵御病原體入侵。有研究發(fā)現(xiàn),在哺乳動(dòng)物中病毒可以通過阻礙IRF7生物學(xué)功能影響宿主抗病毒能力,從而完成自身在宿主中的復(fù)制,但是在禽類上有關(guān)于IRF7的生物學(xué)功能以及病毒是如何作用IRF7以逃避機(jī)體免疫反應(yīng)的研究報(bào)道卻很少,有關(guān)IRF7的很多問題亟待解決。本研究旨在通過構(gòu)建chIRF7的原核和真核表達(dá)質(zhì)粒,研制抗chIRF7單克隆抗體,為今后chIRF7在IFN信號通路中的作用、禽類疾病的基礎(chǔ)性研究提供生物材料。主要研究內(nèi)容和研究結(jié)果包括以下兩部分:1.雞干擾素調(diào)節(jié)因子7基因的克隆與表達(dá)為了獲得雞干擾素調(diào)節(jié)因子7(IRF7)的原核及真核表達(dá)質(zhì)粒,本研究通過分離雞外周血淋巴細(xì)胞,抽提RNA并將其反轉(zhuǎn)錄,獲得雞淋巴細(xì)胞cDNA,將其作為chIRF7基因擴(kuò)增模板。根據(jù)GenBank上已發(fā)布的chIRF7基因序列設(shè)計(jì)合成兩對特異性引物,應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增獲得chIRF7目的基因,將其分別克隆至原核表達(dá)載體pCOLD-TF和真核表達(dá)載體 pcDNA3.1-rIgG 中,構(gòu)建成 pCOLD-TF-chIRF7、pcDNA3.1-chIRF7-rlgG 重組質(zhì)粒。將測序正確的pCOLD-TF-chIRF7質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)中,通過0.25mmol/L異丙基-β-D硫代半乳糖苷低溫誘導(dǎo)20h,經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot驗(yàn)證,結(jié)果顯示融合蛋白HIS-chIFR7能夠獲得表達(dá),且分子量大小為107kDa左右,與預(yù)期目的蛋白大小一致。將測序正確的真核質(zhì)粒經(jīng)TransIT-LT轉(zhuǎn)染入DF-1細(xì)胞,應(yīng)用間接免疫熒光和Western-blot方法進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示重組的chIRF7蛋白在DF-1細(xì)胞中能夠獲得表達(dá)。chIRF7原核及真核重組質(zhì)粒的獲得為進(jìn)一步研制抗chIRF7單克隆抗體提供了材料。2.抗雞干擾素調(diào)節(jié)因子7單克隆抗體的研制為制備針對抗雞干擾素調(diào)節(jié)因子7單克隆抗體,本研究用含原核表達(dá)蛋白產(chǎn)物HIS-chIRF7為免疫原,免疫6周齡BALB/c小鼠,每間隔10天免疫一次,第4次免疫結(jié)束后進(jìn)行細(xì)胞融合。通過利用pcDNA3.1-chIRF7-rIgG真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入DF-1細(xì)胞,并應(yīng)用間接免疫熒光和Westerm blot方法對雜交瘤細(xì)胞上清進(jìn)行篩選,結(jié)果獲得4株能夠穩(wěn)定分泌抗chIRF7單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,將其分別命名為chIRF7-lF12、chIRF7-2B7、chIRF7-5A2、chIRF7-6G7。經(jīng)過兩次亞克隆,雜交瘤細(xì)胞達(dá)到100%分泌抗chIRF7特異性抗體。亞類鑒定結(jié)果表明chIRF7-lF12亞型為IgG2b,其余均為IgGl。通過構(gòu)建5個(gè)chIRF7分段基因的真核質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)染入DF-1細(xì)胞并應(yīng)用間接免疫熒光方法對4株單抗的抗原表位進(jìn)行分析,結(jié)果表明 chIRF7-lF12、chIRF7-2B7、chIRF7-5A2、chIRF7-6G7 抗原表位分別位于chIRF7全長蛋白的36-115aa,184-247aa,36-115aa,142-182aa。應(yīng)用間接免疫熒光方法對4株單抗腹水進(jìn)行效價(jià)測定,結(jié)果表明4株單抗IFA效價(jià)均在1:128000以上。本研究成功制備了抗chIRF7單克隆抗體,為進(jìn)一步研究chIRF7的表達(dá)調(diào)控機(jī)制及其在IFN信號通路中的作用奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

宿主通過ＴＢｋｉ邋／邋ｎＣＫ介導(dǎo)ＩＲＦ３和ＩＲＦ７的a愃嶧�，促进ＩＦＮ基蚁l澩錚憂慷雜繡義閑Э共《久庖哂Υ鴯討兄匾模桑疲斡Υ鴰虻牟�。辶x希桑遙疲吠ü韻氯跬揪恫斡耄尚透扇潘乇澩錚跡玻╁澹哄危ǎ保┩ü裕蹋遙罰梗停模福稿義轄櫚紀(jì)揪�。在ＤＮ俊陡偓有较掇\幢患諄模茫穡腔蛐蛄惺�，可激活ＴＬ＿b雇貳＃螅螅遙危鈴義峽杉せ睿裕蹋遙罰竿貳＃裕蹋遙罰咕ü停模福福桑遙粒耍矗遙粒耍歟裕遙粒疲兜鞍準(zhǔn)っ噶斗從Γ麇義嫌茫桑遙疲罰淞姿嶧�，激活Ｉ型ＩＦＮ基翌R＃ǎ玻┩ü淶模裕蹋遙常裕蹋遙礎(chǔ)ⅲ遙桑牽賞揪叮郟常矗保蕁ｅ義系畢赴徊《靖腥臼�，＿b桑牽傻模茫粒遙那蚪岷喜《競慫幔罨裕攏耍焙停桑耍耍�，续而作泳捔x希桑遙疲返模鄭粒那潁姿嶧們虻乃堪彼岵謝桑遙疲繁舜酥浠蛘呤怯耄桑遙疲承緯啥坼義咸�，，笡]罨畝厶宸⑸碩ㄎ淮影幸浦梁四�，激活Ｉ型ＩＦＮ基覞}褪頭牛尚灣義希桑疲危郟矗�，４３ｌ逦（３）通过ＩＦＮ纂E淼惱蠢〉鶻諭揪�。诞吀胞被病稁葨V�，Ｉ＿b疲繁舜酥溴義閑緯苫罨畝厶

本文編號：2686916