發(fā)布時(shí)間：2020-05-24 01:02

【摘要】：體細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞(Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs)包含眾多的細(xì)胞生理狀態(tài)變化,包括核質(zhì)比增加、線(xiàn)粒體減少和自噬改變等。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),自噬與兔體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(RiPSCs)的過(guò)程密切相關(guān),但其作用機(jī)理尚不清楚。因此,本試驗(yàn)通過(guò)探究RiPSCs誘導(dǎo)過(guò)程中細(xì)胞自噬和能量代謝的相關(guān)變化;在此基礎(chǔ)上,研究雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)促進(jìn)細(xì)胞自噬對(duì)RiPSCs誘導(dǎo)過(guò)程的影響。為解析細(xì)胞自噬在重編程過(guò)程中的作用和豐富重編程機(jī)理奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:1兔iPSCs誘導(dǎo)過(guò)程中自噬的變化:通過(guò)四環(huán)素(Dox)誘導(dǎo)型慢病毒載體將OCT4、SOX2、C-MYC、KLF4(OSKM)導(dǎo)入兔成纖維細(xì)胞(REF)中,觀(guān)察重編程過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)變化,并對(duì)獲得的RiPSCs進(jìn)行免疫熒光及RT-PCR的多能性分析;;接著采用RT-PCR和透射電子顯微鏡的方法對(duì)重編程過(guò)程中細(xì)胞自噬的相關(guān)變化情況進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,在重編程過(guò)程中,細(xì)胞變小、細(xì)胞核變大、細(xì)胞邊緣折光性強(qiáng)、發(fā)生形態(tài)轉(zhuǎn)變的細(xì)胞能夠與未轉(zhuǎn)變的細(xì)胞明顯區(qū)別開(kāi)來(lái),并形成細(xì)胞集落。免疫熒光結(jié)果表明,RiPSCs克隆表達(dá)OCT4、SSEA4,NANOG。在重編程過(guò)程中,多能性基因C-MYC、KLF4、SOX2、OCT4的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì);自噬相關(guān)基因的表達(dá)量也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。透射電鏡結(jié)果顯示,自噬體樣結(jié)構(gòu)在重編程過(guò)程中也是呈現(xiàn)先增多后減少的趨勢(shì)。以上結(jié)果說(shuō)明,RiPSCs誘導(dǎo)過(guò)程中多能基因的表達(dá)和自噬水平均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。2兔iPSCs誘導(dǎo)過(guò)程的代謝變化:本試驗(yàn)采用Mitotracker線(xiàn)粒體特異性標(biāo)記及RT-PCR對(duì)代謝相關(guān)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè);同時(shí),使用細(xì)胞能量代謝儀(Seahorsse XF24 Extracellular Analyzer,XF)對(duì)重編程過(guò)程中的細(xì)胞進(jìn)行線(xiàn)粒體呼吸和糖酵解功能檢測(cè),進(jìn)一步細(xì)胞能量代謝表型進(jìn)行分析,評(píng)估細(xì)胞所處的代謝類(lèi)型。結(jié)果顯示,重編程過(guò)程中線(xiàn)粒體形態(tài)由長(zhǎng)桿狀變成小點(diǎn)狀,數(shù)量迅速減少。線(xiàn)粒體發(fā)生相關(guān)基因NRF1、PCG1αα的表達(dá)量在重編程過(guò)程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì);TFAM、Rad51的表達(dá)量在重編程過(guò)程中呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。糖酵解相關(guān)基因PFK、HK2在RiPSCs中的表達(dá)量達(dá)到最高,PK在RiPSCs中表達(dá)量達(dá)到最低。XF試驗(yàn)結(jié)果顯示,REF、誘導(dǎo)5d細(xì)胞、RiPSCs代謝能力逐漸增強(qiáng);其中REF代謝相對(duì)較弱,偏向于靜息狀態(tài);RiPSCs代謝旺盛,屬于高能量需求類(lèi)型的細(xì)胞,更容易發(fā)生糖酵解。以上結(jié)果說(shuō)明,重編程過(guò)程中細(xì)胞線(xiàn)粒體形態(tài)由長(zhǎng)桿狀轉(zhuǎn)變成小點(diǎn)狀且數(shù)量迅速減少;REF代謝能力相對(duì)較弱,偏向靜息狀態(tài);RiPSCs代謝旺盛,更傾向于發(fā)生糖酵解。3促進(jìn)自噬對(duì)RiPSCs誘導(dǎo)過(guò)程的影響:在前面試驗(yàn)研究基礎(chǔ)上,添加Rapa促進(jìn)細(xì)胞自噬,探討調(diào)控自噬對(duì)RiPSCs誘導(dǎo)效率、重編程過(guò)程中多能性相關(guān)基因、自噬相關(guān)基因的表達(dá)以及細(xì)胞代謝的影響。結(jié)果顯示,添加0.5nM Rapa處理,促進(jìn)自噬顯著提高堿性磷酸酶陽(yáng)性克隆數(shù)和多能性基因C-MYC、OCT4在RiPSCs中的表達(dá)量;重編程過(guò)程中自噬相關(guān)基因表達(dá)水平升高,細(xì)胞自噬體樣結(jié)構(gòu)增加。XF結(jié)果顯示,Rapa抑制了重編程過(guò)程中細(xì)胞線(xiàn)粒體呼吸代謝、降低了糖酵解功能的細(xì)胞代謝。以上結(jié)果表明,促進(jìn)自噬降低了細(xì)胞的生物能量,提高了重編程效率,但同時(shí)也減弱了細(xì)胞對(duì)外界的應(yīng)激抵抗能力。以上結(jié)果表明,在RiPSCs誘導(dǎo)過(guò)程中,細(xì)胞自噬水平呈現(xiàn)先升高后降低,細(xì)胞代謝能力逐漸增強(qiáng);添加雷帕霉素,促進(jìn)細(xì)胞自噬水平,可以通過(guò)降低細(xì)胞的生物能量,從而提高重編程效率,但同時(shí)也減弱了細(xì)胞對(duì)外界的應(yīng)激抵抗能力。
【圖文】：

并換成含Ｄｏｘ的２０Ｋ誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每天換液一次，，同時(shí)活細(xì)胞工作逡逑站下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照記錄。根據(jù)細(xì)胞形變等數(shù)據(jù)得到ＲｉＰＳＣｓ誘導(dǎo)的周期，如逡逑圖１－１所示。逡逑將加入Ｄｏｘ后的誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間計(jì)為０天，根據(jù)誘導(dǎo)過(guò)程中，細(xì)胞的形態(tài)記錄可知，逡逑在誘導(dǎo)的第２天少量細(xì)胞開(kāi)始發(fā)生形態(tài)變化，細(xì)胞變��；誘導(dǎo)的第３天形變的細(xì)胞邊緣逡逑折光性強(qiáng)，細(xì)胞核變大，能夠與未形變細(xì)胞明顯區(qū)別開(kāi)來(lái)；誘導(dǎo)第４天，細(xì)胞^u始聚集；逡逑誘導(dǎo)第５天形變的細(xì)胞聚成集落，第６天集落中的細(xì)胞排列緊密；誘導(dǎo)第８天，形成的逡逑克隆中間開(kāi)始出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，提示可以進(jìn)行傳代培養(yǎng)。根據(jù)記錄得出兔成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)逡逑過(guò)程中細(xì)胞的形態(tài)變化如圖１－２所示。逡逑傳代并換成逡逑ＫＳＲ誘導(dǎo)液逡逑病毒：逡逑感個(gè)染邐ＭＥＴ過(guò)程細(xì)邐個(gè)ＲｉＰＳＣｓ－ｌｉｋｅ邐個(gè)逡逑胞逐漸形變邐克隆形成邋＞邋挑取兗隆逡逑－２ｄ邐Ｏｄ邐５ｄ邐８ｄ邐ｌ0ｄ逡逑圖１－１邋ＯＳＫＭ慢病毒體系下兔ｉＰＳＣｓ的誘導(dǎo)周期逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ邋ｃｙｃｌｅ邋ｏｆ邋ｒａｂｂｉｔ邋ｉＰＳＣｓ邋ｕｎｄｅｒ邋４Ｆ邋ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ邋ｓｙｓｔｅｍ逡逑２３逡逑

并換成含Ｄｏｘ的２０Ｋ誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每天換液一次，同時(shí)活細(xì)胞工作逡逑站下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照記錄。根據(jù)細(xì)胞形變等數(shù)據(jù)得到ＲｉＰＳＣｓ誘導(dǎo)的周期，如逡逑圖１－１所示。逡逑將加入Ｄｏｘ后的誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間計(jì)為０天，根據(jù)誘導(dǎo)過(guò)程中，細(xì)胞的形態(tài)記錄可知，逡逑在誘導(dǎo)的第２天少量細(xì)胞開(kāi)始發(fā)生形態(tài)變化，細(xì)胞變��；誘導(dǎo)的第３天形變的細(xì)胞邊緣逡逑折光性強(qiáng)，細(xì)胞核變大，能夠與未形變細(xì)胞明顯區(qū)別開(kāi)來(lái)；誘導(dǎo)第４天，細(xì)胞^u始聚集；逡逑誘導(dǎo)第５天形變的細(xì)胞聚成集落，第６天集落中的細(xì)胞排列緊密；誘導(dǎo)第８天，形成的逡逑克隆中間開(kāi)始出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，提示可以進(jìn)行傳代培養(yǎng)。根據(jù)記錄得出兔成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)逡逑過(guò)程中細(xì)胞的形態(tài)變化如圖１－２所示。逡逑傳代并換成逡逑ＫＳＲ誘導(dǎo)液逡逑病毒：逡逑感個(gè)染邐ＭＥＴ過(guò)程細(xì)邐個(gè)ＲｉＰＳＣｓ－ｌｉｋｅ邐個(gè)逡逑胞逐漸形變邐克隆形成邋＞邋挑取兗隆逡逑－２ｄ邐Ｏｄ邐５ｄ邐８ｄ邐ｌ0ｄ逡逑圖１－１邋ＯＳＫＭ慢病毒體系下兔ｉＰＳＣｓ的誘導(dǎo)周期逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ邋ｃｙｃｌｅ邋ｏｆ邋ｒａｂｂｉｔ邋ｉＰＳＣｓ邋ｕｎｄｅｒ邋４Ｆ邋ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ邋ｓｙｓｔｅｍ逡逑２３逡逑
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q813

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 李媛;自噬對(duì)重編程的影響及機(jī)制研究[D];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2678224