【摘要】：水稻(Oryza sativa L.)是世界上重要的糧食作物。水稻粒型的研究對(duì)培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的水稻品種具有重要的意義。水稻的粒型包括粒寬、粒長和粒厚,它們?cè)诤艽蟪潭壬嫌绊懰咀蚜５牧Ｖ?最終影響水稻的產(chǎn)量。同時(shí),粒型也是一個(gè)重要的品質(zhì)性狀,它影響到稻米的外觀品質(zhì)、加工品質(zhì)和食用品質(zhì)。盡管目前已經(jīng)克隆出部分控制水稻粒型的基因,但是由于粒型是一個(gè)復(fù)雜性狀,其遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍然有待闡明,需要發(fā)掘和克隆更多的粒型調(diào)控基因,并研究它們的互作關(guān)系。本研究中,通過對(duì)來自于粳稻品種Kitaake組織培養(yǎng)的寬粒突變體lg1-D(large grain1-D)的圖位克隆,發(fā)現(xiàn)了編碼一個(gè)泛素特異性蛋白酶OsUBP15的編碼基因參與了粒型的形成,并對(duì)OsUBP15基因進(jìn)行了功能分析。具體結(jié)果如下:1.與野生型相比,突變體lg1-D籽粒的粒寬、粒長和粒厚分別增加了30.8%、13.23%、13.8%,千粒重增加了30%以上。株高有所降低、穗長縮短,株型和穗型變得直立,分蘗數(shù)和穗粒數(shù)有所減少,單株產(chǎn)量沒有顯著的變化。通過籽粒灌漿過程中干物質(zhì)積累的測定發(fā)現(xiàn)突變體lg1-D的灌漿速率從花后第九天開始顯著高于野生型,從花后12天開始干物質(zhì)積累量顯著高于野生型。2.通過開花前穎殼橫向石蠟切片的觀察和統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),突變體lg1-D穎殼在橫向上細(xì)胞數(shù)目極顯著增加,說明突變體lg1-D粒寬的增加主要是由細(xì)胞數(shù)目的增加引起的;掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)突變體lg1-D穎殼縱向表面的細(xì)胞縮短,推測突變體lg1-D粒長的增加也是由于穎殼縱向細(xì)胞數(shù)目增加引起。3.遺傳分析表明突變體lg1-D由半顯性單基因控制。將突變體lg1-D與秈稻品種協(xié)青早B雜交,利用F_2定位群體將突變基因定位在第2號(hào)染色體短臂物理距離89 kb的區(qū)間內(nèi)。該區(qū)間內(nèi)有6個(gè)ORFs,基因組測序發(fā)現(xiàn),只有ORF2(LOC_02g14730)最后一個(gè)外顯子上存在一個(gè)單堿基的替換,導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止,產(chǎn)生的突變體蛋白在C端缺失了160個(gè)氨基酸殘基。ORF2編碼一個(gè)泛素特異性蛋白酶(OsUBP15)。轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)和干擾驗(yàn)證,OsUBP15的突變就是導(dǎo)致突變體表型的原因,并證明OsUBP15正向調(diào)控水稻粒寬,突變體lg1-D為功能獲得型突變。4.熒光定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)基因植株GUS組織染色實(shí)驗(yàn)證明,OsUBP15呈現(xiàn)組成型表達(dá)模式,在根、莖、葉、葉鞘、幼穗、發(fā)育中的籽粒中均有表達(dá),在幼穗中表達(dá)量相對(duì)較高。通過對(duì)gOsUBP15-GFP轉(zhuǎn)基因株系幼根GFP的觀察發(fā)現(xiàn),OsUBP15在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布。5.體外去泛素實(shí)驗(yàn)證明,OsUBP15蛋白具有去泛素功能,可以從泛素前體上將單個(gè)的泛素分子切割下來。同時(shí)由lg1-D編碼的突變蛋白Osubp15也具有去泛素的功能。說明突變蛋白C-端缺失并沒有失去泛素酶的功能。煙草瞬時(shí)表達(dá)發(fā)現(xiàn)Osubp15-GFP融合蛋白在細(xì)胞中積累量明顯高于OsUBP15-GFP,推測Osubp15蛋白穩(wěn)定性提高,然后通過LUC實(shí)驗(yàn)證明了Osubp15蛋白的穩(wěn)定性高于野生型OsUBP15蛋白。突變體lg1-D表型變化是由于Osubp15蛋白穩(wěn)定性提高,細(xì)胞內(nèi)Osubp15蛋白積累量增加引起的。6.酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)和Pull-down實(shí)驗(yàn)證明OsUBP15能夠和水稻中與擬南芥AtDA1同源的蛋白OsDA1互作,并且OsDA1可以調(diào)控OsUBP15蛋白的降解,這與擬南芥中的報(bào)道一致。突變體蛋白Osubp15也具有和OsDA1互作的能力,但在酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),Osubp15和OsDA1互作的能力比野生型OsUBP15蛋白弱。7.利用CRISPR/CAS9技術(shù),在野生型的背景下敲除OsUBP15使粒寬變窄,敲除GW2使粒寬變寬,而雙突變體lg1-2 gw2-4和lg1-3 gw2-3粒寬并不是典型的加性效應(yīng);在lg1-D背景下將GW2敲除,粒寬增加的幅度低于野生型背景下GW2敲出的株系,說明OsUBP15和GW2在遺傳關(guān)系上并不是完全獨(dú)立的。
【圖文】：

圖 1.1 擬南芥（左）和水稻種子概況（右）。(Li & Li, 2016）Fig 1-1 Overview of seeds in arabidopsis (left) and rice (right).粒型的遺傳分析粒的形狀和大小主要由外部穎殼的形狀和大小決定，而開花后籽粒的灌漿響到籽粒的大小。從遺傳上看，穎殼來自于二倍體的母體植株，其形狀和；而占種子最大體積的胚乳是由三倍體的受精極核發(fā)育來的，胚是由受精形狀和大小可能同時(shí)受到母體植株基因型和合子基因型的影響。另外，或線粒體中的遺傳物質(zhì)也會(huì)影響到籽粒的發(fā)育（石春海等，2003）粒型是一個(gè)復(fù)合性狀，包括粒長、粒寬、長寬比、粒厚、粒重，是由多個(gè)朱軍，2000）。從遺傳力方面看，粒長、粒寬和長寬比的遺傳力較高，在不，而粒厚的遺傳力較低，容易受到環(huán)境的影響（熊振民 & 孔繁林,1982, 石, 易小平,1989）。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，利用不同的遺傳群體，，與水稻粒型相關(guān)的 QTL 位點(diǎn)，它們分布在水稻的所有染色體上（Huang 的控制粒長和粒寬的 QTL，主要表現(xiàn)為加性效應(yīng)，同時(shí)也存在顯性效應(yīng)。性 QTL，同時(shí)存在母性效應(yīng)的影響。長寬比是由粒長和粒寬構(gòu)成的復(fù)合性

圖 1.2 水稻籽粒相關(guān)的 QTL 在染色體上的分布（Huang et al., 2013）Figure 1.2. Distribution of quantitative trait loci (QTLs) for grain traits on rice chromosomes.紅色字體表示已經(jīng)克隆的控制水稻粒型和粒重的主效 QTL，綠色字體表示精細(xì)定位的 QTL 位點(diǎn)，藍(lán)色線段標(biāo)識(shí)初定位的 QTL 的大致位置和數(shù)目。Major QTLs associated with grain shape and weight that have been characterized by gene cloning (labeled in red) or byfine mapping (labeled in green). The locations of QTLs affecting grain shape and weight that have been identified only inprimary mapping experiments are indicated by blue bars with the corresponding number of QTLs.1.3 水稻粒型調(diào)控的分子機(jī)制隨著分子標(biāo)記和測序技術(shù)的發(fā)展，克隆了越來越多的控制水稻籽粒大小的基因，大致涉及以下幾種調(diào)控途徑：轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑；Qg源激素調(diào)控途徑；G 蛋白信號(hào)傳導(dǎo)途徑；泛素-蛋白酶體途徑（圖 1.2）。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S511;Q943.2

【相似文獻(xiàn)】

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1 師翠蘭;水稻粒型調(diào)控基因OsUBP15的圖位克隆與功能分析[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2019年

本文編號(hào)：2672295