【摘要】：磷酸類物質(zhì)是生物體內(nèi)的重要組成成分,維持著生物體的基本生命過程,在生物體內(nèi)的含量異常能作為某些疾病發(fā)生的重要信號。因此,對含磷酸類物質(zhì)的樣品實現(xiàn)簡單、快速、靈敏、高選擇性以及實時的分析具有重要的研究價值。因為熒光分析法具有高的靈敏度、能進行高的時空分辨率成像等優(yōu)勢,目前已經(jīng)發(fā)展的磷酸類物質(zhì)分析方法中,熒光分析法被認為是細胞外磷酸類物質(zhì)檢測和細胞內(nèi)磷酸類物質(zhì)成像最理想的方法。碳點作為一種新型的熒光材料,具有良好的生物相容性、光穩(wěn)定性和較長的斯托克斯位移,有望成為生物傳感中的理想材料。本文以磷酸類物質(zhì)響應(yīng)的功能化碳點及其衍生化探針為主要工具,針對細胞外和細胞內(nèi)磷酸類物質(zhì)進行了定性和定量成像分析,主要內(nèi)容為以下三部分:(1)碳量子點-銪配合物在指紋中磷酸物質(zhì)檢測中的應(yīng)用在這部分工作中,首先利用檸檬酸和L-半胱氨酸為原料,高溫碳化得到具有明亮藍色熒光的碳量子點。然后將制備好的碳量子點中加入硝酸銪溶液,調(diào)節(jié)pH后得到大顆粒的碳量子點-銪配合物。由于碳量子點和銪之間的德克斯特能量轉(zhuǎn)移,因此在紫外光照射下,碳量子點-銪配合物具有藍色和紅色兩種熒光發(fā)射。隨后,我們將構(gòu)建的碳量子點-銪配合物嵌入電紡納米纖維膜中。日光下,該電紡納米纖維膜為白色,而紫外燈下,其發(fā)射出紫紅色的熒光。由于磷酸根和銪具有很強的結(jié)合力,指紋中的磷酸根與碳量子點-銪配合物接觸后,該配合物的結(jié)構(gòu)便會破壞,德克斯特能量轉(zhuǎn)移過程逐漸消失,藍色熒光逐漸增強而紅色熒光逐漸降低。因此,在手指觸摸含有碳量子點-銪配合物的膜之后,在日光燈下該電紡納米纖維膜上看不見任何痕跡,而在紫外燈下卻能看到藍色的指紋印記。該工作成功的對指紋汗液中的磷酸進行了分析,與此同時這種“不可見”藍色熒光指紋分析方法為指紋識別,文件安全及秘密通信領(lǐng)域的應(yīng)用開辟了一條新途徑。(2)正電性單層石墨烯量子點在線粒體內(nèi)ATP成像中的應(yīng)用為了得到具有較大共軛平面的帶正電石墨烯量子點,我們選擇了具有大芳香共軛結(jié)構(gòu)的傒四甲酸酐以及具有豐富氨基的聚乙烯亞胺作為反應(yīng)原料,以乙醇作為溶劑,在封閉聚四氟乙烯反應(yīng)釜中180℃反應(yīng)24小時,得到了大共軛平面的帶正電黃色熒光單層石墨烯量子點(s-GQDs)。由于ATP具有帶負電的三磷酸部分和芳香共軛腺嘌呤部分,因此,s-GQDs可以通過靜電和?-?堆積兩種作用力與ATP結(jié)合。這種結(jié)合會導致s-GQDs聚集以及熒光猝滅,與ATP濃度具有良好線性關(guān)系。因為s-GQDs具有一定程度的疏水性和正電性,所以s-GQDs主要富集于細胞內(nèi)線粒體中。基于此,該工作成功的利用s-GQDs監(jiān)測了活細胞線粒體中ATP濃度的波動。(3)雙發(fā)射熒光碳點在細胞內(nèi)線粒體靶向與ATP成像中的應(yīng)用為得到線粒體靶向且對ATP具有雙重熒光響應(yīng)的碳點,我們用富含氨基的聚乙烯亞胺和乙酰乙撐基三苯基膦作為碳點的反應(yīng)原料,首先制備了表面富含氨基和三苯基膦(TPP)基團的藍色熒光碳點。然后,利用氨基和硫氰酸根間的親核加成反應(yīng),將異硫氰酸熒光素(FITC)修飾在了碳點表面,最終得到了具有強藍色熒光和弱綠色熒光的TPP-CDs-FITC熒光碳點。ATP的加入會導致TPP-CDs-FITC熒光碳點的聚集并增強CDs到FITC的能量轉(zhuǎn)移,使CDs藍色熒光降低且FITC綠色熒光增強。由于熒光碳點中修飾的TPP部分具有線粒體靶向性,以及CDs-FITC部分的ATP響應(yīng)性,將TPP-CDs-FITC復合探針與細胞孵育之后,可以通過細胞內(nèi)藍色熒光與綠色熒光的強度比值,更準確與直觀的實時監(jiān)控活細胞線粒體中ATP的濃度變化�？偟膩碚f,本研究利用碳點豐富的表面官能團,通過有目的的合成與修飾,制備了對磷酸類物質(zhì)具有特殊響應(yīng)的功能化碳點及其衍生物。由于碳點良好的生物相容性、較長的斯托克斯位移以及高光穩(wěn)定性,這些功能化碳點及其衍生物被成功地應(yīng)用到了指紋中磷酸類物質(zhì)傳感和線粒體中ATP成像。本工作為功能化碳點的制備及其衍生化提供了新的研究思路,同時對碳點在分析傳感、生物成像等方面的應(yīng)用也具有重要指導意義。
【圖文】：

成了核苷磷酸，如三磷酸腺苷（ATP）、三磷酸鳥苷（GTP）、三磷酸胞苷（CTP）、酸尿苷（UTP）等。此外，四磷酸鳥苷（ppGpp）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）、腺嘌呤二核苷酸（FAD）等也是常見的磷酸類物質(zhì)。磷酸類物質(zhì)在生物體內(nèi)廣在，參與多種生物化學和細胞代謝過程，對于維持生物體的正常生理功能扮演分重要的作用。其中，ATP 是生物體各項生命活動最直接的能量來源，，被形象為生物體的“能量貨幣”。除此之外，ATP 還是細胞內(nèi)一種重要的信號調(diào)停分在神經(jīng)末梢周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的化學感應(yīng)轉(zhuǎn)換中起著重要的作用。同時，AT與了細胞內(nèi) DNA 的合成[1]。三磷酸鳥苷（GTP）在 RNA 合成以及檸檬酸循環(huán)演了重要的角色[2-4]。此外，GTP 也是蛋白質(zhì)合成的重要能量來源。三磷酸尿UTP）是生物體能量傳遞的供體并參與了代謝過程的一系列酶促反應(yīng)等[5]。磷物質(zhì)也是生物體內(nèi)的一種重要信號分子，異常的表達能為某些疾病的診斷或生態(tài)的判斷提供依據(jù)。例如，ATP 的含量是評價血液活力的重要指標，也是決定樣能否用于輸血的重要因素[6]。ppGpp 水平的變化是環(huán)境脅迫導致細菌產(chǎn)生應(yīng)應(yīng)的重要胞內(nèi)信號[7-9]。

2）提高光穩(wěn)定性。目前發(fā)展的很多磷酸類物質(zhì)成像探針都是熒光針穩(wěn)定性較差，不利于長時間成像且會影響成像效果。3）改善生物相容性。很多半導體量子點以及熒光染料建立的磷酸方法都會帶來生物毒性，影響生物體的正常生理狀態(tài)。上所述，制備具有良好選擇性、光穩(wěn)定性高、生物相容性好的功能細胞外和細胞內(nèi)磷酸類物質(zhì)進行檢測與成像具有重要意義。內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動態(tài)分析酸類物質(zhì)的分析文的研究對象主要是生物體內(nèi)重要的磷酸類物質(zhì)，包括 Pi、PPi 以酸（ATP、GTP、CTP、UTP）。目前已經(jīng)報道的這些物質(zhì)分析方法主離[11-13]、化學發(fā)光[14,15]、電化學原理[16-18]、吸光光度法[19-21]以及熒中熒光法由于具有操作簡單、靈敏度高、可用于實時成像等優(yōu)點，酸類物質(zhì)的分析傳感中。其中，利用熒光法分析磷酸類物質(zhì)的體系
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：O657.3;Q-33

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本文編號：2672109