發(fā)布時(shí)間：2020-05-20 05:05

【摘要】：磷酸類(lèi)物質(zhì)是生物體內(nèi)的重要組成成分,維持著生物體的基本生命過(guò)程,在生物體內(nèi)的含量異常能作為某些疾病發(fā)生的重要信號(hào)。因此,對(duì)含磷酸類(lèi)物質(zhì)的樣品實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、快速、靈敏、高選擇性以及實(shí)時(shí)的分析具有重要的研究?jī)r(jià)值。因?yàn)闊晒夥治龇ň哂懈叩撵`敏度、能進(jìn)行高的時(shí)空分辨率成像等優(yōu)勢(shì),目前已經(jīng)發(fā)展的磷酸類(lèi)物質(zhì)分析方法中,熒光分析法被認(rèn)為是細(xì)胞外磷酸類(lèi)物質(zhì)檢測(cè)和細(xì)胞內(nèi)磷酸類(lèi)物質(zhì)成像最理想的方法。碳點(diǎn)作為一種新型的熒光材料,具有良好的生物相容性、光穩(wěn)定性和較長(zhǎng)的斯托克斯位移,有望成為生物傳感中的理想材料。本文以磷酸類(lèi)物質(zhì)響應(yīng)的功能化碳點(diǎn)及其衍生化探針為主要工具,針對(duì)細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)磷酸類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行了定性和定量成像分析,主要內(nèi)容為以下三部分:(1)碳量子點(diǎn)-銪配合物在指紋中磷酸物質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用在這部分工作中,首先利用檸檬酸和L-半胱氨酸為原料,高溫碳化得到具有明亮藍(lán)色熒光的碳量子點(diǎn)。然后將制備好的碳量子點(diǎn)中加入硝酸銪溶液,調(diào)節(jié)pH后得到大顆粒的碳量子點(diǎn)-銪配合物。由于碳量子點(diǎn)和銪之間的德克斯特能量轉(zhuǎn)移,因此在紫外光照射下,碳量子點(diǎn)-銪配合物具有藍(lán)色和紅色兩種熒光發(fā)射。隨后,我們將構(gòu)建的碳量子點(diǎn)-銪配合物嵌入電紡納米纖維膜中。日光下,該電紡納米纖維膜為白色,而紫外燈下,其發(fā)射出紫紅色的熒光。由于磷酸根和銪具有很強(qiáng)的結(jié)合力,指紋中的磷酸根與碳量子點(diǎn)-銪配合物接觸后,該配合物的結(jié)構(gòu)便會(huì)破壞,德克斯特能量轉(zhuǎn)移過(guò)程逐漸消失,藍(lán)色熒光逐漸增強(qiáng)而紅色熒光逐漸降低。因此,在手指觸摸含有碳量子點(diǎn)-銪配合物的膜之后,在日光燈下該電紡納米纖維膜上看不見(jiàn)任何痕跡,而在紫外燈下卻能看到藍(lán)色的指紋印記。該工作成功的對(duì)指紋汗液中的磷酸進(jìn)行了分析,與此同時(shí)這種“不可見(jiàn)”藍(lán)色熒光指紋分析方法為指紋識(shí)別,文件安全及秘密通信領(lǐng)域的應(yīng)用開(kāi)辟了一條新途徑。(2)正電性單層石墨烯量子點(diǎn)在線粒體內(nèi)ATP成像中的應(yīng)用為了得到具有較大共軛平面的帶正電石墨烯量子點(diǎn),我們選擇了具有大芳香共軛結(jié)構(gòu)的傒四甲酸酐以及具有豐富氨基的聚乙烯亞胺作為反應(yīng)原料,以乙醇作為溶劑,在封閉聚四氟乙烯反應(yīng)釜中180℃反應(yīng)24小時(shí),得到了大共軛平面的帶正電黃色熒光單層石墨烯量子點(diǎn)(s-GQDs)。由于ATP具有帶負(fù)電的三磷酸部分和芳香共軛腺嘌呤部分,因此,s-GQDs可以通過(guò)靜電和?-?堆積兩種作用力與ATP結(jié)合。這種結(jié)合會(huì)導(dǎo)致s-GQDs聚集以及熒光猝滅,與ATP濃度具有良好線性關(guān)系。因?yàn)閟-GQDs具有一定程度的疏水性和正電性,所以s-GQDs主要富集于細(xì)胞內(nèi)線粒體中�；诖�,該工作成功的利用s-GQDs監(jiān)測(cè)了活細(xì)胞線粒體中ATP濃度的波動(dòng)。(3)雙發(fā)射熒光碳點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)線粒體靶向與ATP成像中的應(yīng)用為得到線粒體靶向且對(duì)ATP具有雙重?zé)晒忭憫?yīng)的碳點(diǎn),我們用富含氨基的聚乙烯亞胺和乙酰乙撐基三苯基膦作為碳點(diǎn)的反應(yīng)原料,首先制備了表面富含氨基和三苯基膦(TPP)基團(tuán)的藍(lán)色熒光碳點(diǎn)。然后,利用氨基和硫氰酸根間的親核加成反應(yīng),將異硫氰酸熒光素(FITC)修飾在了碳點(diǎn)表面,最終得到了具有強(qiáng)藍(lán)色熒光和弱綠色熒光的TPP-CDs-FITC熒光碳點(diǎn)。ATP的加入會(huì)導(dǎo)致TPP-CDs-FITC熒光碳點(diǎn)的聚集并增強(qiáng)CDs到FITC的能量轉(zhuǎn)移,使CDs藍(lán)色熒光降低且FITC綠色熒光增強(qiáng)。由于熒光碳點(diǎn)中修飾的TPP部分具有線粒體靶向性,以及CDs-FITC部分的ATP響應(yīng)性,將TPP-CDs-FITC復(fù)合探針與細(xì)胞孵育之后,可以通過(guò)細(xì)胞內(nèi)藍(lán)色熒光與綠色熒光的強(qiáng)度比值,更準(zhǔn)確與直觀的實(shí)時(shí)監(jiān)控活細(xì)胞線粒體中ATP的濃度變化�？偟膩�(lái)說(shuō),本研究利用碳點(diǎn)豐富的表面官能團(tuán),通過(guò)有目的的合成與修飾,制備了對(duì)磷酸類(lèi)物質(zhì)具有特殊響應(yīng)的功能化碳點(diǎn)及其衍生物。由于碳點(diǎn)良好的生物相容性、較長(zhǎng)的斯托克斯位移以及高光穩(wěn)定性,這些功能化碳點(diǎn)及其衍生物被成功地應(yīng)用到了指紋中磷酸類(lèi)物質(zhì)傳感和線粒體中ATP成像。本工作為功能化碳點(diǎn)的制備及其衍生化提供了新的研究思路,同時(shí)對(duì)碳點(diǎn)在分析傳感、生物成像等方面的應(yīng)用也具有重要指導(dǎo)意義。
【圖文】：

成了核苷磷酸，如三磷酸腺苷（ATP）、三磷酸鳥(niǎo)苷（GTP）、三磷酸胞苷（CTP）、酸尿苷（UTP）等。此外，四磷酸鳥(niǎo)苷（ppGpp）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）、腺嘌呤二核苷酸（FAD）等也是常見(jiàn)的磷酸類(lèi)物質(zhì)。磷酸類(lèi)物質(zhì)在生物體內(nèi)廣在，參與多種生物化學(xué)和細(xì)胞代謝過(guò)程，對(duì)于維持生物體的正常生理功能扮演分重要的作用。其中，ATP 是生物體各項(xiàng)生命活動(dòng)最直接的能量來(lái)源，，被形象為生物體的“能量貨幣”。除此之外，ATP 還是細(xì)胞內(nèi)一種重要的信號(hào)調(diào)停分在神經(jīng)末梢周?chē)椭袠猩窠?jīng)系統(tǒng)的化學(xué)感應(yīng)轉(zhuǎn)換中起著重要的作用。同時(shí)，AT與了細(xì)胞內(nèi) DNA 的合成[1]。三磷酸鳥(niǎo)苷（GTP）在 RNA 合成以及檸檬酸循環(huán)演了重要的角色[2-4]。此外，GTP 也是蛋白質(zhì)合成的重要能量來(lái)源。三磷酸尿UTP）是生物體能量傳遞的供體并參與了代謝過(guò)程的一系列酶促反應(yīng)等[5]。磷物質(zhì)也是生物體內(nèi)的一種重要信號(hào)分子，異常的表達(dá)能為某些疾病的診斷或生態(tài)的判斷提供依據(jù)。例如，ATP 的含量是評(píng)價(jià)血液活力的重要指標(biāo)，也是決定樣能否用于輸血的重要因素[6]。ppGpp 水平的變化是環(huán)境脅迫導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生應(yīng)應(yīng)的重要胞內(nèi)信號(hào)[7-9]。

2）提高光穩(wěn)定性。目前發(fā)展的很多磷酸類(lèi)物質(zhì)成像探針都是熒光針?lè)�(wěn)定性較差，不利于長(zhǎng)時(shí)間成像且會(huì)影響成像效果。3）改善生物相容性。很多半導(dǎo)體量子點(diǎn)以及熒光染料建立的磷酸方法都會(huì)帶來(lái)生物毒性，影響生物體的正常生理狀態(tài)。上所述，制備具有良好選擇性、光穩(wěn)定性高、生物相容性好的功能細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)磷酸類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)與成像具有重要意義。內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動(dòng)態(tài)分析酸類(lèi)物質(zhì)的分析文的研究對(duì)象主要是生物體內(nèi)重要的磷酸類(lèi)物質(zhì)，包括 Pi、PPi 以酸（ATP、GTP、CTP、UTP）。目前已經(jīng)報(bào)道的這些物質(zhì)分析方法主離[11-13]、化學(xué)發(fā)光[14,15]、電化學(xué)原理[16-18]、吸光光度法[19-21]以及熒中熒光法由于具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、可用于實(shí)時(shí)成像等優(yōu)點(diǎn)，酸類(lèi)物質(zhì)的分析傳感中。其中，利用熒光法分析磷酸類(lèi)物質(zhì)的體系
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：O657.3;Q-33

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本文編號(hào)：2672109