【摘要】：興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(excitatory amino acid transporter,EAATs)是一種 Na+依賴性興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體,主要功能是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外興奮性氨基酸的濃度,研究發(fā)現(xiàn)EAAT3表達(dá)下降與海馬相關(guān)的學(xué)習(xí)認(rèn)知功能損害存在相關(guān)性。重組腺相關(guān)病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)作為質(zhì)粒穿梭載體具有安全性高、免疫原性低、宿主范圍廣、表達(dá)穩(wěn)定、物理性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),是一種有效的基因傳遞載體系統(tǒng)。短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)在細(xì)胞內(nèi)可被核酸酶切割成雙鏈siRNA,與目標(biāo)mRNA靶點(diǎn)結(jié)合后促使靶mRNA的降解,也是一種被廣泛應(yīng)用的基因調(diào)控工具。雖然已有研究發(fā)現(xiàn)若干有關(guān)EAAT3功能調(diào)節(jié)途徑,但尚未發(fā)現(xiàn)高選擇性性的化合物,本研究擬通過(guò)構(gòu)建能表達(dá)shRNA的rAAV載體,建立一種敲減小鼠海馬EAAT3表達(dá)的動(dòng)物模型,為進(jìn)一步研究EAAT3調(diào)控機(jī)制和相關(guān)分子信號(hào)通路打下研究基礎(chǔ)。第一部分EAAT3敲減rAAV載體的構(gòu)建、鑒定及篩選目的構(gòu)建EAAT3敲減rAAV及其對(duì)照rAAV,以作為EAAT3敲減模型的基礎(chǔ)。方法基于 SLC1A1(solute carrier family 1 member 1)基因 mRNA 序列設(shè)計(jì) 4 條 shRNA編碼基因 mSLC1A1-1、mSLC1A1-2、mSLC1A1-3、mSLC1A1-4 和 1 條陰性對(duì)照序列NC,與酶切后的pAAV-U6-EGFP載體質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化,挑取陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒、pHelper包裝質(zhì)粒和pAAV-DJ輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至AAV-293 細(xì)胞包裝得到 rAAV-shRNA-SLC1A1-1-EGFP、rAAV-shRNA-SLC 1A1-2-EGFP、rAAV-shRNA-SLC 1A1-3-EGFP、rAAV-shRNA-SLC1A1-4-EGFP、rAAV-shRNA-NC-EGFP 這 5 種 rAAV。用所得 rAAV侵染HT-22細(xì)胞,72h后RT-qPCR檢測(cè)SLC1A1 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定,插入位置和序列與設(shè)計(jì)一致,成功構(gòu)建了重組干擾質(zhì)粒;經(jīng)有限梯度稀釋法鑒定計(jì)數(shù)重組感染滴度約為1×1013TU/ml;2-A△Ct法分析SLC1A1基因相對(duì)表達(dá)量與NC組相比,mSLC1A1-3組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,mSLC1A1-1組、mSLC1A1-4組SLC1A1表達(dá)量下降(P0.01),mSLC1A1-2組表達(dá)量最低約為NC組的 42%(P0.01)。結(jié)論成功構(gòu)建了 EAAT3敲減rAAV,其中干擾序列為“GCTGATCGTATCCAGCATGAT”(5'-3')的腺相關(guān)病毒rAAV-shRNA-SLC1A1-2-EGFP抑制EAAT3表達(dá)的效果最佳。第二部分小鼠海馬注射rAAV敲減EAAT3效果的檢驗(yàn)?zāi)康臋z測(cè)小鼠海馬注射rAAV后EAAT3表達(dá)水平的變化,實(shí)現(xiàn)EAAT3敲減模型的構(gòu)建。方法72只成年C57小鼠隨機(jī)分為6組,每組12只,予海馬注射rAAV-shRNA-SLC1A1-2-EGFP 病毒液 1 μ 1/側(cè)(1 × 1013 TU/ml),分別于注射后即刻、24h、7d、14d、21d、28d取雙側(cè)海馬組織,每組隨機(jī)抽取6只分別行RT-qPCR和Western blot檢測(cè)EAAT3表達(dá)水平。結(jié)果與對(duì)照組CON組相比,小鼠海馬EAET3表達(dá)量隨時(shí)間持續(xù)而下降,兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基本趨勢(shì)相同;在海馬注射后第21d,mRNA表達(dá)量下降至對(duì)照組的43.1%(P=0.043),蛋白表達(dá)量降至37.4%(P0.01);注射后第28d,轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物分別下降到對(duì)照組的30%和25%(P0.01)。結(jié)論rAAV-shRNA-SLC1A1-2-EGFP海馬注射可有效敲減成年小鼠海馬EAAT3的表達(dá),其中在注射后28d表達(dá)量最低。第三部分海馬注射rAAV對(duì)LPS致認(rèn)知障礙小鼠行為學(xué)的影響目的利用腦室注射LPS致認(rèn)知功能障礙小鼠模型,觀察海馬注射rAAV后對(duì)小鼠認(rèn)知相關(guān)行為學(xué)的影響。方法10周齡C57小鼠48只,隨機(jī)分為數(shù)量均等的4組。分別為陰性對(duì)照組(NC組)、EAAT3敲減組(RNAi組)、認(rèn)知障礙組(LPS組)、認(rèn)知障礙+EAAT3敲減組(LPS+RNAi組)。NC組和LPS組雙側(cè)海馬注射對(duì)照病毒液1 μ L/側(cè),RNAi組和LPS+RNAi組雙側(cè)海馬注射效應(yīng)病毒液1 μ L/側(cè)(1 × 1013 TU/mL)。21d后NC組和RNAi組側(cè)腦室注射 aCSF 2 μ L,LPS 組和 RNAi+LPS 組側(cè)腦室注射 LPS 溶液 2 μ L(1000ng/μ L)。所有動(dòng)物海馬注射后第15d進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn),第16d水迷宮空間獲得性訓(xùn)練5天;21d行側(cè)腦室注射,側(cè)腦室注射后1-3d進(jìn)行空間探索測(cè)試和工作記憶測(cè)試,結(jié)果 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)各組動(dòng)物移動(dòng)距離和運(yùn)動(dòng)總時(shí)比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;水迷宮空間獲得性訓(xùn)練各組小鼠登臺(tái)潛伏期(s)從第1天到第4天逐漸縮短,訓(xùn)練第4、5天潛伏期時(shí)長(zhǎng)較第1天相比,潛伏期時(shí)長(zhǎng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.024);空間探索測(cè)試各組小鼠游泳總距離和平均速度之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;穿臺(tái)數(shù)NC組高于其他各組且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.034),其他各組相比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;進(jìn)入目標(biāo)象限次數(shù)NC 組高于 RNAi 組和 LPS+RNAi 組(P=0.037),LPS 高于 LPS+RNAi 組(P=0.037)。工作記憶測(cè)試第1天NC登臺(tái)潛伏期低于LPS+RNAi組(P=0.029)。結(jié)論敲減小鼠海馬EAAT3可降低小鼠在行為學(xué)測(cè)試中的表現(xiàn),并可加重LPS所致認(rèn)知障礙。
【圖文】：

圖１－２有限稀釋熒光計(jì)數(shù)法測(cè)定ａＡＡＶ滴度約為１邋ｘｌ0ｉ３ＴＵ／ｍｌ。圖中標(biāo)尺長(zhǎng)度為５０邋ｗ邋ｍ逡逑３．邋ＲＴ－ｑＲＣＲ檢測(cè)ＨＴ－２２細(xì)胞ＥＡＡＴ３表達(dá)：２－ＡＡＱ法分析ＥＡＡＴ３基因與內(nèi)參ＧＡＰＤＨ逡逑的相對(duì)表達(dá)量；與ＮＣ組相比（圖１－３），邋ｍＳＬＣｌＡｌ－３組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＾＝０．９７３１），逡逑ｍＳＬＣｌＡｌ－１邋組、ｍＳＬＣｌＡｌ－４邋組邋ＥＡＡＴ３邋表達(dá)量約為邋ＮＣ邋組的邋６２．９％和邋６９．７％（Ｐ＜０．０１邋），逡逑ｍＳＬＣｌＡｌ－２組表達(dá)量最低，約為ＮＣ組的４２％邋（Ｐ＜０．０１）。逡逑￡邋１．５－逡逑Ｉ一邋ａ逡逑ｍＳｍ逡逑邐１邐逡逑ｖｖｖｖ’逡逑圖丨－３ＨＴ－２２細(xì)胞ＳＬＣ１Ａ１基因相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表示為均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（ｎ＝３），邋Ｔ＜０．０１，與逡逑ＮＣ組比較。逡逑討邋論逡逑興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體３邋（ＥＡＡＴ３）是興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體５個(gè)亞型中的一種，主逡逑２５逡逑

在海馬注射后第２１ｄ，邋Ｄ２１組相對(duì)表達(dá)量約為ＣＯＮ組的４３．１％，尸＝０．０４３；注射后第逡逑２８ｄ，Ｄ２８組相對(duì)表達(dá)量降至ＣＯＮ組的３０％，尸＜０．０１；其余Ｄｌ、Ｄ７、Ｄ１４組表達(dá)量逡逑下降差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖２－１）。逡逑￡邋２．５－１逡逑＜逡逑Ｐ邋２．０－逡逑ＩＩＩ逡逑Ｚ．邋１．５－邐ｔ逡逑ｉ１0邋ＩＩ邋Ｌ邐ａ逡逑ｄＭ．ｉｉ逡逑Ｅ邐ＣＯＮ邋Ｄ１邋Ｄ７邋Ｄ１４邐Ｄ２１邐Ｄ２８逡逑圖２－１邋ＲＴ－ｑＰＣＲ檢測(cè)海馬ＥＡＡＴ３相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表示為均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（ｎ＝６），邋ａＰ＜０．０５，，ＡＰ＜０．０１，逡逑與ＣＯＮ組比較）逡逑２．邐ＷＢ檢測(cè)海馬ＥＡＡＴ３蛋白相對(duì)表達(dá)量：統(tǒng)計(jì)ＥＡＡＴ３與內(nèi)參ＧＡＰＦＨ條帶灰度逡逑值比值，即ＥＡＡＴ３／ＧＡＰＤＨ蛋白相對(duì)表達(dá)量；與對(duì)照組ＣＯＮ組相比，注射后２４ｈ海逡逑馬組織相對(duì)表達(dá)下降無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Ｐ＝0．３２６；Ｄ７、Ｄ１４、Ｄ２１、Ｄ２８各組蛋白相對(duì)表逡逑達(dá)較ＣＯＮ組明顯降低，其中２１ｄ、２８ｄ表達(dá)量約為對(duì)照組的３７．４％和２５％，戶＜０．０１。逡逑（圖邋２－２）。逡逑３３逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q78;R614

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本文編號(hào)：2671336