【摘要】：紫花苜蓿(Medicago sativa.)是在國內(nèi)大范圍種植的牧草,具有產(chǎn)量高,品質(zhì)好,適應(yīng)性好等優(yōu)點(diǎn)。Ca~(2+)是植物逆境脅迫下的主要調(diào)控因子,而CBL/CIPK信號(hào)調(diào)控系統(tǒng)對(duì)Ca~(2+)起很大的調(diào)控作用。因此本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)苜蓿CIPK基因進(jìn)行研究。本研究利用對(duì)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)存的CIPK基因功能缺失突變體(cipk3、cipk5、cipk11、cipk18、cipk21)進(jìn)行篩選,將具有高度敏感表型的CIPK3基因列為主要研究的基因。蒺藜苜蓿與紫花苜蓿的高度同源性(99%)且為模式植物,本研究主要研究了蒺藜苜蓿R108的CIPK3基因。利用同源序列比對(duì)法獲得蒺藜苜蓿CIPK3基因序列,采用生物信息學(xué)相關(guān)技術(shù)對(duì)CIPK3基因進(jìn)行蛋白組學(xué)及功能分析;以此為基礎(chǔ),探究CIPK3基因在不同脅迫(高鹽脅迫、干旱脅迫及ABA脅迫)下的表達(dá)水平,本試驗(yàn)采用了實(shí)時(shí)熒光定量(qRT-PCR)技術(shù)來進(jìn)行分析;構(gòu)建蒺藜苜蓿R108 CIPK3基因的功能過表達(dá)載體2×35 Sp CAMBIA1300-CIPK3,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥成功獲得了CIPK3基因過表達(dá)的植株,隨后運(yùn)用轉(zhuǎn)基因擬南芥來進(jìn)行初步功能的研究。主要研究結(jié)果如下:1.蒺藜苜蓿CIPK3基因的cDNA全長(zhǎng)為1293 bp,編碼430個(gè)氨基酸殘基。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示CIPK3基因編碼蛋白內(nèi)不含有信號(hào)肽,存在兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,主要定位于細(xì)胞質(zhì),推測(cè)其為在細(xì)胞質(zhì)中行使功能的非分泌蛋白,并且與鷹嘴豆、大豆、百脈根、豇豆等豆科植物親緣關(guān)系較近,而與擬南芥、蘋果、玉米、小麥、水稻等植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。2.蒺藜苜蓿CIPK3基因在植株的根和葉片中均有一定量的表達(dá),且在葉片中的相對(duì)表達(dá)量是在根中的3.84倍。當(dāng)受到高鹽脅迫、干旱脅迫及ABA脅迫時(shí),CIPK3基因在植株的各部位的表達(dá)水平都表現(xiàn)出一定量的上調(diào),并且表達(dá)水平會(huì)根據(jù)脅迫處理時(shí)間的不同發(fā)生相應(yīng)的變化。在受到ABA脅迫時(shí),CIPK3基因的相對(duì)表達(dá)水平的上升幅度最大,高鹽脅迫其次,干旱脅迫時(shí)變化幅度最小。3.通過篩選得到轉(zhuǎn)CIPK3基因擬南芥的T3代植株后,對(duì)其進(jìn)行高鹽脅迫處理,以野生型為對(duì)照觀察表型,驗(yàn)證CIPK3基因在脅迫環(huán)境下的功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn),CIPK3基因?qū)ΨN子萌發(fā)有積極作用,且植株的根長(zhǎng)存在顯著差異,初步推測(cè)其通過維持植株體內(nèi)正常的離子平衡來維持植物正常生長(zhǎng)。綜上所述,本研究最終驗(yàn)證了蒺藜苜蓿CIPK3在植物受到非生物脅迫時(shí)能顯著地提高植物的抗逆性,為后期研究抗逆性強(qiáng)的紫花苜蓿打下了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1-1 CBL/CIPK 復(fù)合體在調(diào)節(jié)細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)中的作用模型。f calcineurin B-like (CBL) CBLinteracting protein kinase (CIPK) funcellular ion homeostasis白家族的結(jié)構(gòu)現(xiàn)了與動(dòng)物 CNB( B subunit of calcineurin)、 NCS( neurona序列同源性的蛋白家族，由于該蛋白家族是未知的，為了名為CBL ( Zhu et al.1998; Kudla et al.1999)。CBL的結(jié)構(gòu)：?jiǎn)♀彔畹挠梢粋�(gè)較短連接域連接起來的兩個(gè)球形區(qū)域，是域。任意一個(gè)CBL蛋白上都存在4個(gè)EF手型結(jié)構(gòu)，其能與邊EF手型結(jié)構(gòu)上，各自存在一個(gè)α螺旋，并且1(X)，3(Y)，Z)這幾個(gè)位置上的氨基酸是結(jié)合Ca2+必需的( Kudla et al.2 EF手型位點(diǎn)數(shù)目的不同（一個(gè)、兩個(gè)或不包含典型位點(diǎn)分為三組( Batisticand.2009; Sánchez-Barrena et al.2013)。除

圖 1-1 CBL/CIPK 復(fù)合體在調(diào)節(jié)細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)中的作用模型。Fig.1-1 Model of calcineurin B-like (CBL) CBLinteracting protein kinase (CIPK) function in regulatingcellular ion homeostasis1.1.1 CBL 蛋白家族的結(jié)構(gòu)植物中發(fā)現(xiàn)了與動(dòng)物 CNB( B subunit of calcineurin)、 NCS( neuronal calcium sensor)白具有高度序列同源性的蛋白家族，由于該蛋白家族是未知的，為了方便研究，，研人員將其命名為CBL ( Zhu et al.1998; Kudla et al.1999)。CBL的結(jié)構(gòu)：CBL蛋白的C端在一個(gè)類似啞鈴狀的由一個(gè)較短連接域連接起來的兩個(gè)球形區(qū)域，是主要跟CIPK蛋的結(jié)合的區(qū)域。任意一個(gè)CBL蛋白上都存在4個(gè)EF手型結(jié)構(gòu)，其能與Ca2+高度親和，圖2所示，兩邊EF手型結(jié)構(gòu)上，各自存在一個(gè)α螺旋，并且1(X)，3(Y)，5(Z)，7(－Y)，(－X)和12(－Z)這幾個(gè)位置上的氨基酸是結(jié)合Ca2+必需的( Kudla et al.2009; Lewit etl.2000)。根據(jù) EF手型位點(diǎn)數(shù)目的不同（一個(gè)、兩個(gè)或不包含典型位點(diǎn)）可以將CBL白大致可以分為三組( Batisticand.2009; Sánchez-Barrena et al.2013)。除此之外，CBL白還有一個(gè)N端序列，該序列的主要功能是決定 CBL/ CIPK復(fù)合體的亞細(xì)胞定位。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S541;Q943.2

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