【摘要】：鏈霉菌(Streptomyces)是一種有著復(fù)雜生命周期的革蘭氏陽性細(xì)菌,可以合成多種有生物活性的次生代謝產(chǎn)物。天藍(lán)色鏈霉菌(Steptomyces coelicolor)是最具代表性的模式菌株,其基因組于2002年完成測序。分析表明,其基因組可編碼68對雙組份信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),13種孤兒調(diào)控蛋白和17種孤兒傳感激酶。孤兒調(diào)控蛋白在染色體上單獨(dú)存在,并且在相鄰位置沒有與其配對的基因。這些調(diào)控蛋白大多在鏈霉菌應(yīng)答環(huán)境刺激和代謝產(chǎn)物生成調(diào)控中扮演重要的角色。本研究對孤兒調(diào)控蛋白SC03008在分化發(fā)育及次級代謝過程中發(fā)揮的調(diào)控功能進(jìn)行了初步研究。選取天藍(lán)色鏈霉菌(Steptomyces coelicolor)M145基因文庫中sco3008陽性克隆22G7,通過PCR-targeting方法在cosmid 22G7中進(jìn)行sco3008的缺失突變,然后通過大腸桿菌與鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)sco3008的突變,并獲得突變菌株△3008。選取多種培養(yǎng)基來分析由sco3008基因缺失引起的表型差異,在MS-G、MS-M、R2YE固體培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn),△3008表現(xiàn)出對氣生菌絲一定程度的損傷以及放線紫紅素(Act)和十一烷基靈菌紅素(Red)的過量差生。YBP固體培養(yǎng)基上,△3008表現(xiàn)出更為明顯的表型缺陷,整個觀察周期內(nèi)未產(chǎn)生明顯的氣生菌絲,表現(xiàn)出“光禿”表型;在次生代謝方面,△3008顯示出比M145更顯著的放線紫紅素(Act)及十一烷基靈菌紅素(Red)過量產(chǎn)生。為了確定△3008的表型缺陷是由于sco3008的缺失造成的,我們構(gòu)建了△3008互補(bǔ)菌株,表型分析發(fā)現(xiàn)回補(bǔ)菌株在分化發(fā)育和次級代謝方面的表型變化都得到了完全的恢復(fù),這說明突變株△3008的表型缺陷是由于sco3008的缺失造成的。我們通過RNA-Seq分析了野生型M145及突變株△3008基因的表達(dá)差異,并界定了SC03008在體內(nèi)調(diào)節(jié)的基因集群。與M145相比,△3008有135個基因表達(dá)量顯著上調(diào),包括放線紫紅素合成基因簇、十一烷基靈菌紅素合成基因簇;引起表達(dá)量下調(diào)的多達(dá)568個基因,包括編碼氣生菌絲生長和孢子成熟基因如chaplin基因、rodlin基因、bld基因、whi基因、wbl基因、膜蛋白編碼基因,以及一些功能未知的結(jié)構(gòu)基因。表明孤兒調(diào)控基因sco3008在調(diào)節(jié)天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)分化發(fā)育和次生代謝中起重要的作用。為了尋找SC03008在鏈霉菌體內(nèi)直接調(diào)控的靶基因,我們構(gòu)建了SC03008-Flag融合蛋白互補(bǔ)菌株,該菌株能夠完全回補(bǔ).sco3008缺失造成的表型缺陷,而且能夠有效表達(dá)SC03008-Flag融合蛋白。我們利用該菌株進(jìn)行了ChIP-Seq試驗(yàn)并輔助ChIP-qPCR和DNA-Pull Down試驗(yàn)成功找到SC03008在體內(nèi)直接調(diào)控的2個靶基因,分別是wblA和sco13 75。表明SC03008對鏈霉菌分化發(fā)育和次生代謝的調(diào)控是通過調(diào)節(jié)這兩個基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。為了進(jìn)一步探討調(diào)控蛋白SC03008對天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)分化發(fā)育和次生代謝的影響,在本研究中,采用外源性的強(qiáng)啟動子構(gòu)建SC03008過表達(dá)菌株。表型分析顯示該菌株產(chǎn)生的氣生菌絲少于野生菌株M145,并且過量產(chǎn)生放線紫紅素,這表明孤兒調(diào)控蛋白SC03008的調(diào)控功能很可能與其蛋白表達(dá)量有關(guān),即表達(dá)量水平較低時(shí),調(diào)控功能是促進(jìn)氣生菌絲的形成、抑制放線紫紅素Act產(chǎn)量;表達(dá)量水平較高時(shí),則表現(xiàn)為抑制氣生菌絲的產(chǎn)生、促進(jìn)放線紫紅素Act過量表達(dá)。綜上所述,我們可以明確孤兒調(diào)控蛋白SC03008在分化發(fā)育及次級代謝方面的調(diào)控機(jī)制,是一個重要的全局性調(diào)控因子。
【圖文】：

因在染色體上單獨(dú)存在的稱為孤兒基因；除此之外，還存在更為復(fù)雜的非典型雙逡逑組份系統(tǒng)：以多個傳感激酶或多個應(yīng)答調(diào)控蛋白排列成基因簇的形式存在如逡逑圖１．２。之外，一些研宄發(fā)現(xiàn)還存在“三組份信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)”。逡逑３逡逑

ＲＲ邋ｇｅｎｅｓ逡逑｜邐｜邐Ｎｏｒｔ－ＴＣＳ邋ｇｅｎｅｓ逡逑圖１．２雙組份信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)基因形式分類逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．２邋Ｇｅｎｅ邋ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ邋ｆｏｒｍ邋ｏｆＴＣＳｓ１＇９１逡逑原核生物雙組份系統(tǒng)中的組氨酸感應(yīng)激酶通常為跨膜蛋白，具有典型的二聚逡逑體膜受體，包括感應(yīng)域、激酶域、催化域（結(jié)合并水解ＡＴＰ）。感應(yīng)域的功能主逡逑要是識別信號；在檢測到信號后，，組氨酸激酶水解ＡＴＰ并在激酶結(jié)構(gòu)域中保守逡逑的組氨酸殘基上自身磷酸化；ＡＴＰ結(jié)合域含有六個保守的序列，在羧基末端又四逡逑個保守基序：Ｎ、Ｇｌ、Ｆ和Ｇ２，在空間結(jié)構(gòu)上形成“ＡＴＰ結(jié)合口袋”，特異性結(jié)逡逑合ＡＴＰｌＭ。感應(yīng)調(diào)控蛋白，負(fù)責(zé)傳遞組氨酸感應(yīng)激酶傳遞來的信號，感應(yīng)調(diào)控蛋逡逑白是胞質(zhì)蛋白，結(jié)構(gòu)上分為兩部分：Ｎ－末端是含有能夠接受磷酸基的天冬氨酸殘逡逑基的調(diào)控區(qū)域；Ｃ－末端為效應(yīng)區(qū)域
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q936

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 王新圓;天藍(lán)色鏈霉菌調(diào)控蛋白SCO3008的功能研究[D];山東大學(xué);2019年

本文編號：2666775