【摘要】：物種要延續(xù)下去,保存遺傳信息并將其完整無誤地傳遞給后代是十分重要的。這一過程依賴于完整可靠的DNA復(fù)制過程。DNA復(fù)制過程如果變得不穩(wěn)定或者失去控制,無法保證各類遺傳信息的正確傳遞和表達(dá),就會造成生物體的各種缺陷及包括癌癥在內(nèi)的各類疾病甚至死亡。生物體已經(jīng)擁有了一套強(qiáng)大完整的DNA復(fù)制體系來完成遺傳物質(zhì)的傳遞。但是復(fù)雜的體系也會有失靈的風(fēng)險(xiǎn),為了應(yīng)對這些風(fēng)險(xiǎn),生物體配置了對應(yīng)的DNA復(fù)制檢驗(yàn)點(diǎn)機(jī)制以及修復(fù)機(jī)制。復(fù)制檢驗(yàn)點(diǎn)維持真核細(xì)胞的基因組穩(wěn)定性。在每一個(gè)周期的基因組復(fù)制過程中,細(xì)胞不可避免地受到內(nèi)源性或外源性復(fù)制應(yīng)激的挑戰(zhàn),包括異常的DNA結(jié)構(gòu)、DNA損傷、蛋白質(zhì)阻礙、癌基因誘導(dǎo)的異常復(fù)制、dNTP或組蛋白供應(yīng)不足、復(fù)制轉(zhuǎn)錄沖突等等。復(fù)制檢驗(yàn)點(diǎn)又稱S期檢驗(yàn)點(diǎn),它幫助細(xì)胞應(yīng)對上述挑戰(zhàn),確保在整個(gè)基因組復(fù)制前進(jìn)行正確的復(fù)制叉進(jìn)程。除了復(fù)制基因組外,DNA復(fù)制叉還為許多在DNA復(fù)制檢查點(diǎn)起作用的信號蛋白提供了一個(gè)組裝平臺。在釀酒酵母中,Mec1在DNA復(fù)制檢驗(yàn)點(diǎn)通路中處于核心地位,它參與感知停滯的DNA復(fù)制叉,是哺乳動物細(xì)胞中ATR的同源蛋白。Ddc2(哺乳動物ATRIP同源蛋白)作為Mec1的調(diào)節(jié)亞單位,與Mec1形成蛋白質(zhì)復(fù)合物。Mec1-Ddc2復(fù)合物通過復(fù)制蛋白A(RPA)包裹的單鏈DNA被招募到停滯的復(fù)制叉處。Hus1、Rad1和Rad9是復(fù)制檢查點(diǎn)所需的另外三種蛋白質(zhì),它們形成的三聚體復(fù)合物與PCNA較為相似。這個(gè)三聚體在釀酒酵母中的同源物是Mec3-Rad1-Ddc1。復(fù)制檢查點(diǎn)的另一個(gè)必要因素是Rad17(釀酒酵母中為Rad24),它類似于一個(gè)RFC亞單位,并且與RFCs2-5結(jié)合形成復(fù)合物。有人提出,與PCNA和RFCs1-5類似,Rad24-RFC復(fù)合體將Mec3-Rad17-Ddc1復(fù)合體加載到DNA損壞或復(fù)制受阻的位置。一旦被加載,Mec3-Rad17-Ddc1復(fù)合物會激活Mec1。Mrc1(mediator of replication checkpoint)是DNA復(fù)制體的一個(gè)組成部分,在DNA合成過程中隨復(fù)制叉沿著染色體移動。MRC1的缺失導(dǎo)致DNA復(fù)制缺陷,表明其在DNA復(fù)制的正常進(jìn)展中的作用。同時(shí),Mrc1也參與釀酒酵母和裂殖酵母細(xì)胞對羥基脲的反應(yīng)。當(dāng)DNA復(fù)制被羥基脲阻斷時(shí),Mrc1會經(jīng)歷Mec1和Rad3(Mec1的S.Pombe同源蛋白)依賴的磷酸化,Mrc1作為中介體,參與將復(fù)制應(yīng)激信號從Mec1傳遞到Rad53效應(yīng)激酶的過程。而在這個(gè)過程中,Rad24-RFC同樣起著重要作用,可能參與調(diào)節(jié)Mrc1的磷酸化。有文獻(xiàn)報(bào)道,磷酸化的Mrc1會將Mec1對Rad53的激活效率提高70倍左右。盡管人們對Mrc1在復(fù)制檢查點(diǎn)中的作用進(jìn)行過許多研究,然而,Mrc1的結(jié)構(gòu)特征如何,與DNA有怎樣的相互作用,與Rad24-RFC存在著怎樣的相互作用且兩者的相互作用受何種因素影響,這些問題都還沒有任何信息。為了解決這一問題,我首先嘗試在釀酒酵母S.cerevisiae中內(nèi)源純化Mrc1,通過酵母同源重組的方法改造基因組,在目的基因后加入TAPm標(biāo)簽,再通過親和層析的方法獲得Mrc1。但由于體內(nèi)與Mrc1相互作用的蛋白很多,且Mrc1的本底表達(dá)水平較低,這種本底表達(dá)后內(nèi)源純化的策略很不適用。幸運(yùn)的是,我們獲得了來自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)樓慧強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室的饋贈——pGEX-4T-3-Mrc1重組表達(dá)質(zhì)粒,可以在大腸桿菌重組表達(dá)系統(tǒng)中較好地表達(dá)全長的Mrc1。此外,我又在大腸桿菌中重組表達(dá)了釀酒酵母截短的Mrc1,獲得了質(zhì)量較好的Mrc1(287-1096AA)。我們利用體外孵育,得到了Mrc1(287-1096AA)與5' flap DNA的復(fù)合物。通過電鏡三維重構(gòu)的方法,我們解析了 Mrc1的第一個(gè)負(fù)染電鏡結(jié)構(gòu),了解到Mrc1是一個(gè)接近環(huán)狀的中介體蛋白,它可以將DNA“握住”,作為復(fù)制體的一部分,沿著DNA滑動。另外,我們還重組表達(dá)了Mrc1(1-567AA),將其與5' flap DNA進(jìn)行了體外孵育,通過電鏡分析發(fā)現(xiàn),截短后的Mrc1,無論是Mrc1(287-1096AA)還是Mrc1(1-567AA),與DNA的親和力都有明顯提高,這可能是截短后Mrc1的DNA結(jié)合區(qū)域暴露出來的緣故。我們由此猜測,Mrc1的C端與N端之間存在一種別構(gòu)調(diào)節(jié),當(dāng)C端與N端相互作用形成后,會別構(gòu)抑制C端一側(cè)的DBD與DNA的親和力。DNA的正確順利復(fù)制是保證遺傳信息穩(wěn)定性的關(guān)鍵步驟,復(fù)制體如何結(jié)合DNA,產(chǎn)生復(fù)制壓力后復(fù)制體如何響應(yīng)并傳遞信號到下游通路,這是一個(gè)極其重要的課題。本文的工作以中介體蛋白Mrc1為切入點(diǎn),通過電鏡分析,闡述了Mrc1作為復(fù)制體的一部分,它整體趨于環(huán)狀中心有孔洞的結(jié)構(gòu)特征、且通過中心孔洞與DNA的結(jié)合及它與clamp loader Rad24-RFC的相互作用,更加豐富地認(rèn)識了 Mrc1在DNA復(fù)制及復(fù)制壓力應(yīng)激反應(yīng)中所發(fā)揮的作用,豐富了人們對復(fù)制叉行進(jìn)及復(fù)制檢驗(yàn)點(diǎn)的認(rèn)識。
【圖文】：

圖１－１真核生物復(fù)制起始過程示意圖（0，邋Ｄｏｎｎｅｌｌ邋ｅｔ邋ａｌ．，２0ｌ３）逡逑注：真核生物通過將起始事件分為細(xì)胞周期的不同階段，并對ＤＮＡ復(fù)制的起始機(jī)種調(diào)控過程，達(dá)到了精細(xì)的控制水平。Ｐｒｅ－ＲＣ的形成發(fā)生在快速增殖的真核細(xì)胞結(jié)束期間或細(xì)胞周期的Ｇ１期，但ＭＣＭ２－７螺旋酶在加載到ｄｓＤＮＡ后仍然不活躍。叉的建立是由多種因子（最重要的是ＣＤＣ４５和ＧＩＮＳ．）的染色質(zhì)結(jié)合來調(diào)節(jié)的，夠激活ＭＣＭ２－７螺旋酶活性。在Ｓ期，ＣＤＣ６和ＣＤＴ１蛋白通過選擇性蛋白降解或除，從而阻止了邋ＭＣＭ２－７在Ｓ期的進(jìn)一步加載和再活化。復(fù)制原點(diǎn)是由ＭＣＭ２－７結(jié)束期或Ｇ１期加載，然后在Ｓ期激活。通過將螺旋酶加載和ＤＮＡ合成步驟分為兩個(gè)不同階段，真核生物阻止復(fù)制原點(diǎn)多次啟動。復(fù)制后，細(xì)胞進(jìn)入Ｇ２期，然。逡逑３逡逑

Ｖ邋ｓｔｒａｎｄ逡逑．魏逡逑圖１－２真核生物復(fù)制叉組分示意圖（Ｏ’邋Ｄｏｎｎｅｌｌ邋ｅｔ邋ａＬ，邋２０１３）逡逑圖注：圖片提出了一種真核生物復(fù)制體的結(jié)構(gòu)。ＭＣＭ２－７螺旋酶圍繞著主鏈，，通過與ＧＩＮＳ和逡逑ＣＤＣ４５結(jié)合起來形成ＣＭＧ復(fù)合體，對ＤＮＡ雙鏈進(jìn)行解旋。ＲＦＣ邋ｃｌａｍｐ邋ｌｏａｄｅｒ反復(fù)將ＰＣＮＡ邋（增殖逡逑細(xì)胞核抗原）ｃｌａｍｐ加載到由Ｐｏｌ邋ａ－ｐｒｉｍａｓｅ形成的滯后鏈引物上。與大腸桿菌不同，ｃｌａｍｐ逡逑４逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q75

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