【摘要】：甜瓜(Cucumis melo L.)是一種普遍栽培且具有較高經(jīng)濟(jì)價值的園藝作物,其儲存及運(yùn)輸成為影響經(jīng)濟(jì)價值的重要因素。熱休克蛋白(Heat shock proteins,HSPs)作為一種分子伴侶,具有抗應(yīng)激、抗氧化、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等重要的生物學(xué)功能。木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶(Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase,XTH)屬于細(xì)胞壁松弛酶,在果實(shí)成熟階段對細(xì)胞壁的重構(gòu)起重要作用。本研究以甜瓜品種河套蜜瓜(Cucumis melo L.cv Hetao)為研究材料,對本實(shí)驗(yàn)室前期完成的甜瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,從上述兩個基因家族中各選取一個在果實(shí)發(fā)育過程中呈顯著差異表達(dá)的基因CmHsp70-9和CmXTH28-2,分析生物信息學(xué)特性,分析兩個基因在甜瓜不同組織和不同發(fā)育時期果實(shí)中的表達(dá)譜,克隆其cDNA序列,并分別構(gòu)建超表達(dá)載體和基因編輯載體,對甜瓜進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,對T_1果實(shí)進(jìn)行表型鑒定,獲得了以下主要結(jié)果:1.生物信息學(xué)鑒定獲得10個Hsp70和3個IIIB亞類XTH家族成員,通過分析發(fā)現(xiàn)兩個基因的成員在結(jié)構(gòu)和進(jìn)化上是相對保守的。2.表達(dá)譜分析顯示:CmHsp70-9和CmXTH28-2均在果實(shí)中表達(dá),四個時期中呼吸躍變后期表達(dá)量最高,生長期表達(dá)量較低,且兩者在根莖葉中均有一定量的表達(dá)。3.應(yīng)用RT-PCR方法克隆出CmHsp70-9和CmXTH28-2各自的cDNA,長度分別為2131 bp和1190 bp。4.用CmHsp70-9和CmXTH28-2基因的超表達(dá)載體pPHsp70、pPXTH28和基因編輯載體pYL-Hsp70、pYL-XTH28對甜瓜進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,獲得的T_1代種子,PCR檢測轉(zhuǎn)化植株的陽性率發(fā)現(xiàn):pPHsp70:14.28%;pYL-Hsp70:8.33%;pPXTH28:17.85%;pYL-XTH28:13.09%。對T_1果實(shí)成熟期觀察表明,對照果實(shí)平均成熟時期為46天,獲得轉(zhuǎn)化pPHsp70超表達(dá)載體T_1果實(shí)11個,其平均成熟時期為43天,比對照早熟3天;獲得轉(zhuǎn)化pYL-Hsp70編輯載體的具有晚熟表型的T_1果實(shí)1個,其成熟期為55天,比對照晚熟9天。獲得轉(zhuǎn)化CmXTH28超表達(dá)載體T_1果實(shí)9個,其平均成熟時期為41天,比對照早熟5天。綜上所述,初步研究結(jié)果表明CmHsp70和CmXTH28基因均具有促進(jìn)果實(shí)成熟的作用。
【圖文】：

在正常情況下表達(dá)極少或不表達(dá)，而在熱激或其他脅迫條件下表達(dá)迅速增強(qiáng)，屬于誘導(dǎo)SP[61]。根據(jù)其在細(xì)胞中的定位情況，Hsp70 可以分為 4 個亞族：細(xì)胞質(zhì) Hsp70、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)70、線粒體 Hsp70 和葉綠體 Hsp70[62]。對其結(jié)構(gòu)功能了解比較清楚也比較有代表性的有以個成員：HSP70、HSC70、PBP74、GRP78[63]。2 Hsp70 家族的結(jié)構(gòu)特征及主要功能Hsp70 蛋白高度保守，大約由 650 個氨基酸組成，X 光衍射晶體分析表明，Hsp70 的結(jié)包括 2 個主要功能結(jié)構(gòu)區(qū)域：核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Nucleotide binding domain, NBD)和底物結(jié)構(gòu)域(Substrate binding domain, SBD)[62,64-65]，即含有 ATP 酶結(jié)構(gòu)域(ATPase domain)的 N其具有 ATPase 酶活性，氨基酸序列高度保守；含多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Peptide-binding domai-端區(qū)域，，其又可以分為 2 個亞區(qū)，緊連 ATPase 結(jié)構(gòu)域，是 Hsp70 與多肽底物的結(jié)合部該兩區(qū)域之間由一絞鏈部分相連（圖 1.1）[61]。

圖 2.1 兩基因靶位點(diǎn)示意圖T1：上游編輯位點(diǎn)；T2：下游編輯位點(diǎn)。Figure 2.1 Map of target sites of each geneT1: Upstream editing site; T2: Downstream editing site證有較高的編輯效率，將靶序列的 GC 含量>40%，最好為 50%-70%之間，同時現(xiàn)連續(xù)的 T，以及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)�？捎� mFOLD 軟件對 sgRNA 的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)有二級結(jié)構(gòu)的序列，以提高編輯效率。物接頭及通用引物回溶至 5 pmol/L，而編輯引物回溶至 15 pmol/L，分別取引物，90℃反應(yīng) 10 s 準(zhǔn)備好接頭，后置于-20℃保存。sgRNA 進(jìn)行組裝，首先驗(yàn)證 BsaI 活性及載體，具體做法為：利用限制性內(nèi)切酶 sgRNA 的兩個中間載體取 200-300 ng pYLCRISPR/Cas9 載體（有兩個 BsaI 位點(diǎn)g pYLsgRNA 載體（有三個 BsaI 位點(diǎn)）進(jìn)行酶切鑒定，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行 1%的瓊檢測，以驗(yàn)證酶切效率。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S652;Q943.2

【相似文獻(xiàn)】

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1 張鴻;甜瓜CmHsp70-9及CmXTH28-2基因的克隆及其在果實(shí)發(fā)育中功能的初步鑒定[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2019年

本文編號：2655730