【摘要】：α-法尼烯是一種倍半萜類揮發(fā)性有機(jī)化合物,存在于多種植物的葉片、花和果實(shí)中,它在植物防御中扮演著重要角色,同時(shí)也與植物的抗冷性、昆蟲的誘導(dǎo)及低溫貯藏的蘋果和梨果實(shí)重大的生理代謝紊亂-虎皮病的發(fā)生有關(guān)。法尼烯又是一種優(yōu)良生物燃料法尼烷的前體,近年來受到了人們的廣泛關(guān)注,具有廣闊的市場(chǎng)價(jià)值。以往有關(guān)α-法尼烯的研究大多集中在其代謝途徑中關(guān)鍵酶的基因克隆、生物學(xué)功能和代謝工程上,而轉(zhuǎn)錄因子對(duì)蘋果α-法尼烯生物合成的調(diào)控機(jī)制未見報(bào)道。本項(xiàng)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),蘋果中的轉(zhuǎn)錄因子MdMYC2(bHLH轉(zhuǎn)錄因子)和MdERF3(Ethylene response factor 3)能夠激活α-法尼烯合成途徑中最后一步關(guān)鍵酶基因MdAFS的啟動(dòng)子區(qū)域,上調(diào)MdAFS基因的表達(dá),從而使下游產(chǎn)物α-法尼烯得到積累。主要結(jié)論如下:(1)利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)MdAFS基因在青香蕉蘋果葉片的激素誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)MdAFS基因表達(dá)受茉莉酸(JA)、乙烯(ETH)、脫落酸(ABA)、水楊酸(SA)激素的調(diào)節(jié)。在常溫和低溫儲(chǔ)藏條件下,利用JA、ETH處理蘋果果實(shí)均能促進(jìn)α-法尼烯的合成,而1-MCP處理則抑制α-法尼烯的合成。(2)利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)MdAFS基因啟動(dòng)子進(jìn)行分析預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)域存在多種響應(yīng)植物激素(ETH、JA、ABA)和非生物脅迫的順式作用元件,以及多個(gè)MYB、MYC結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)的分析,我們篩選到了茉莉酸、乙烯途徑中的重要轉(zhuǎn)錄因子MdMYC2、MdERF3,研究α-法尼烯合成的調(diào)控機(jī)制。qRT-PCR分析結(jié)果表明,JA、ETH處理誘導(dǎo)MdMYC2、MdERF3的上調(diào)表達(dá),同時(shí)MdAFS也上調(diào)表達(dá),表明MdMYC2、MdERF3與MdAFS基因表達(dá)具有相關(guān)性。(3)煙草熒光素酶試驗(yàn)表明,轉(zhuǎn)錄因子MdMYC2和MdERF3能夠激活MdAFS基因啟動(dòng)子。酵母單雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄因子MdMYC2和MdERF3可以在體外結(jié)合MdAFS基因啟動(dòng)子。EMSA試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄因子MdERF3能夠與MdAFS啟動(dòng)子上的DRE元件直接結(jié)合。在蘋果愈傷組織中分別過表達(dá)MdMYC2和MdERF3,MdAFS基因的表達(dá)量均升高,而沉默MdMYC2的愈傷組織中,MdAFS基因的表達(dá)量降低。(4)利用果實(shí)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系在青香蕉蘋果果皮中過量表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子MdMYC2和MdERF3,GC-MS檢測(cè)結(jié)果表明,過表達(dá)MdMYC2和MdERF3顯著促進(jìn)了α-法尼烯的合成。(5)轉(zhuǎn)錄因子MdMYC2和MdERF3還同時(shí)影響α-法尼烯合成途徑中的其它關(guān)鍵酶基因HMGR和FPPS的表達(dá),表明轉(zhuǎn)錄因子MdMYC2和MdERF3通過激活α-法尼烯代謝途徑中多個(gè)基因的協(xié)同表達(dá),有效地提高α-法尼烯的合成量。
【圖文】：

蘋果轉(zhuǎn)錄因子 MdMYC2 與 MdERF3 對(duì) -法尼烯生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并且具有抗癌、消炎等作用，如紫杉醇對(duì)卵巢癌和乳腺癌有明wein et al., 2001），青蒿素是治療瘧疾的特效藥。其次，揮發(fā)性的萜類香氣的主要來源，因此被廣泛應(yīng)用于香料、香水、食品及化妝品等行03）。此外，萜類結(jié)構(gòu)的多樣性使得一些萜類化合物近年來被開發(fā)應(yīng)為燃料的前體。萜類化合物作為次生代謝產(chǎn)物不僅具有重要的藥用在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用（圖 1-1）。首先當(dāng)植物受到植食性，植物釋放的萜類揮發(fā)物一方面直接驅(qū)除來抵御動(dòng)物和害蟲的侵害等萜類物質(zhì)能抵抗煙芽夜蛾的活性(姜永幸等，1997)，另一方面它性動(dòng)物或害蟲的天敵，作為化學(xué)信號(hào)起到間接防御的作用（McCorm其次，植物產(chǎn)生的萜類物質(zhì)對(duì)于傳粉者有顯著吸引作用，從而有利于后代。萜類物質(zhì)還可以保護(hù)植物免受病原菌的侵害（Huang et al., 2

圖 1-2 植物中萜類物質(zhì)的合成途徑（Nagegowda, 2010）Fig. 1-2 The pathway of terpeniods biosynthesis in plant (Nagegowda, 2010).3 萜類物質(zhì)代謝工程植物萜類物質(zhì)含量極低，，分子結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，化學(xué)合成困難且成本高，因此工程的手段提高目標(biāo)萜類的產(chǎn)量已經(jīng)成為熱點(diǎn)。大腸桿菌和釀酒酵母是進(jìn)行常見的兩種微生物。與很多萜類相似，β-香樹脂醇在植物中的含量很低，化率不高，因而限制了其規(guī)�；a(chǎn)和廣泛應(yīng)用。有研究在釀酒酵母中構(gòu)建了β-香樹脂醇的合成途徑，并不斷改善發(fā)酵過程，最終使 β-香樹脂醇產(chǎn)量.7±8.62mg/L，與初始工程菌相比提高了 209 倍（張根林，2015）。紫杉醇是一物堿，廣泛應(yīng)用于抗癌藥物中，是一種有效且必需的組成成分。在大腸桿菌中采用代謝途徑工程的多變量模塊化方法，成功的提高了紫杉醇中間體紫杉（Ajikumar et al., 2010）。法尼烯最早從蘋果樹中分離得到（Huelin and Mu6），在植物防御方面起到重要作用。在大腸桿菌菌株中過表達(dá)含有甲羥戊酸途
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2652592