【摘要】：漆酶催化酚類和芳香基類化合物的氧化還原反應(yīng),利用O_2作為電子受體催化底物,不需輔因子參與,水是反應(yīng)過程唯一副產(chǎn)物,是典型的環(huán)境友好“綠色催化劑”。真菌漆酶雖已商業(yè)化,但由于在堿性環(huán)境下活性很低甚至失活,熱穩(wěn)定性也較差,大大限制了在印染廢水等堿性廢水中的應(yīng)用。相較之下,芽孢桿菌的CotA漆酶,雖天然催化活性略低,但在堿性pH及高溫下具有良好酶活,pH與熱穩(wěn)定性非常好,能耐受較高的鹽濃度和有機(jī)溶劑,更適合在印染廢水處理中推廣應(yīng)用。然而CotA漆酶為芽孢外壁蛋白,呈不溶狀態(tài),難以分離純化,限制了CotA漆酶的應(yīng)用。本論文以巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)CotA漆酶D501G/L386W/G417L/G57F(縮寫為GWLF)的分泌表達(dá),該漆酶是本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的來源于短小芽孢桿菌且催化效率有大幅提高的一個(gè)優(yōu)異突變體。根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好性對GWLF基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化,將優(yōu)化后的基因整合到畢赤酵母基因組上,成功實(shí)現(xiàn)了GWLF在畢赤酵母中的分泌表達(dá)。重組GWLF為分子量約75 kDa的二聚體蛋白。在搖瓶水平優(yōu)化重組畢赤酵母誘導(dǎo)條件,結(jié)果表明,將重組畢赤酵母在含有0.25 mmol·L~(-1) Cu~(2+)和0.5%(w/v)山梨醇的BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基(pH 7.0)中,每隔24 h補(bǔ)加1.0%(v/v)甲醇,在26℃下誘導(dǎo)表達(dá)144 h,最終獲得GWLF最高酶活為4092 U·L~(-1)。參考搖瓶最適誘導(dǎo)條件,在5 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵中,重組GWLF最終酶活達(dá)到17080 U·L~(-1)。生物毒性實(shí)驗(yàn)表明重組GWLF可以有效催化降解偶氮染料伊文斯藍(lán)。通過液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)一步研究了GWLF對伊文斯藍(lán)的脫色和降毒反應(yīng)機(jī)制,顯示伊文斯藍(lán)中的偶氮鍵在降解過程中轉(zhuǎn)化成氮?dú)舛粫?huì)生成有毒的苯胺類物質(zhì)。本研究為首次闡明細(xì)菌漆酶催化伊文斯藍(lán)降解機(jī)制。
【圖文】：

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文被氧化，某些介體小分子可以作為漆酶和底物之間的電子穿梭載體，調(diào)節(jié)化還原電位，對底物進(jìn)行間接氧化，形成漆酶介體系統(tǒng)(Laccase-mediato1]。經(jīng)常使用的介體包括 2,2'-二氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)、丁香醛連三唑、N-羥基-N-乙酰基苯胺、三苯胺、N-乙酰苯胺、紫脲酸等[12]。漆酶介物的機(jī)理如圖 1-1 所示。LMS 系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)擴(kuò)大了漆酶的底物范圍，并且在廢紙脫墨、染料降解和生物漂白等中得到了進(jìn)一步應(yīng)用。

物的機(jī)理如圖 1-1 所示。LMS 系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)擴(kuò)大了漆酶的底物范圍，，并且在廢紙脫墨、染料降解和生物漂白等中得到了進(jìn)一步應(yīng)用。圖 1-1 有介體存在的情況下漆酶催化底物氧化示意圖Fig. 1-1 Laccase-catalyzed oxidation of substrates in the presence of mediator酶的催化機(jī)制酶催化反應(yīng)機(jī)制較復(fù)雜，主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面[13]：) 生成底物自由基中間體。酶催化氧化酚類和芳胺類底物時(shí),首先從底物分子中獲得一個(gè)電子，使之成，該自由基并不穩(wěn)定，可以再次發(fā)生聚合或者解聚等非酶催化反應(yīng)[1]，漆子后呈還原態(tài)，在氧氣的存在下，還原態(tài)的漆酶被氧氣氧化，氧氣最終被細(xì)反應(yīng)過程如圖 1-2 所示[14]:
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：2651843