【摘要】：巨噬細(xì)胞(macrophage)在固有免疫中發(fā)揮重要作用,受到病原菌刺激后產(chǎn)生多種與炎癥相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子,調(diào)控炎癥的進(jìn)程。同時(shí),巨噬細(xì)胞具有強(qiáng)大的吞噬能力,抗原提呈能力,能夠直接吞噬、殺傷入侵病原菌,從而在調(diào)控固有免疫和適應(yīng)性免疫的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。目前的研究證實(shí),巨噬細(xì)胞是一類異質(zhì)性的免疫細(xì)胞,具有較強(qiáng)的可塑性,能對(duì)環(huán)境信號(hào)作出有效反應(yīng),并根據(jù)刺激信號(hào)改變表型和生理功能,對(duì)病原體引起的炎癥發(fā)生和消退至關(guān)重要。一般認(rèn)為巨噬細(xì)胞主要分為兩類,一類是經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞(classically activated macrophage),也稱之為M1,是一群促炎性的巨噬細(xì)胞;另一種是選擇性活化的巨噬細(xì)胞(alternatively activated macrophage),也稱之為M2,是一群抑炎性的巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞不同的細(xì)胞表型,在應(yīng)對(duì)不同的微環(huán)境時(shí)能夠發(fā)揮不同的生理功能,以調(diào)控整個(gè)免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)。MEF2C是MEF2家族中重要的一員。作為特異性的轉(zhuǎn)錄因子,MEF2C在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、心臟形態(tài)發(fā)生、肌細(xì)胞分化中起到重要的作用。近年來(lái)研究證實(shí)MEF2C在炎癥和T/B淋巴細(xì)胞的發(fā)育等免疫相關(guān)生理病理狀態(tài)中也起到重要作用。本研究中,我們首先用siRNA干擾巨噬細(xì)胞MEF2C基因表達(dá),LPS刺激后發(fā)現(xiàn)IL-12、IL-23、iNOS等M1細(xì)胞的分子標(biāo)志(marker)表達(dá)顯著下調(diào),而IL-10、Arg-1等M2細(xì)胞的分子標(biāo)志(marker)表達(dá)升高,過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)得出相一致的結(jié)果。同時(shí),我們誘導(dǎo)培養(yǎng)M1和M2巨噬細(xì)胞,RT-PCR和WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MEF2C在M1細(xì)胞中高表達(dá),而在M2細(xì)胞中低表達(dá),以上結(jié)果提示MEF2C可能在巨噬細(xì)胞極化中起重要作用。利用新構(gòu)建的巨噬細(xì)胞MEF2C特異性敲除的小鼠,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞MEF2C缺陷,其M1 marker CD11c表達(dá)明顯下調(diào),而M2 marker CD206表達(dá)明顯升高。在LPS體內(nèi)誘導(dǎo)的炎癥模型和李斯特菌感染模型中,RT-PCR等檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MEF2C缺陷的巨噬細(xì)胞表型與體外結(jié)果一致。在李斯特菌感染模型中,我們發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞MEF2C缺陷的小鼠在脾和肝等臟器內(nèi)李斯特菌的載量比對(duì)照組明顯增多,且巨噬細(xì)胞MEF2C缺陷的小鼠肝臟損傷也更嚴(yán)重;感染致死劑量李斯特菌后,MEF2C缺陷組死亡率高于對(duì)照組。同時(shí),體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞MEF2C缺陷殺傷李斯特菌的能力也明顯減弱。體外T細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)表明,巨噬細(xì)胞MEF2C缺陷LPS刺激收取的上清,誘導(dǎo)Naive CD4T細(xì)胞分化為T(mén)h1細(xì)胞能力明顯減弱。分子機(jī)制上,我們通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí),MEF2C可以直接結(jié)合到IL-12和IL-10的啟動(dòng)子上調(diào)控其基因的轉(zhuǎn)錄。綜上所述,我們實(shí)驗(yàn)證實(shí),MEF2C通過(guò)調(diào)控IL-12/IL-10基因的表達(dá),從而調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化和Th1細(xì)胞反應(yīng),進(jìn)而調(diào)控機(jī)體的固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。
【圖文】：

圖２．１．１邋ｐＣＭＶ－Ｔａｇ－２Ｂ質(zhì)粒骨架圖譜逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１．１邋ｐＣＭＶ－Ｔａｇ－２Ｂ邋ｖｅｃｔｏｒ邋ｍａｐ逡逑酶報(bào)告基因系統(tǒng)包含２個(gè)熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，分ｐＭＩＲ－ＲＥＰＯＲＴＴＭ邋Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ邋和邋ｐＲＬ－ＴＫ－Ｒｅｎｉｌｌａ邋對(duì)、ＩＬ－１２ｐ４０亞基和ＩＬ－１０基因的ｐｒｏｍｏｔｏｒ序列均插入３－ＲＥＰＯＲＴＴＭ邋Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ的多克隆位點(diǎn)，，從而構(gòu)建－１０的報(bào)告基因質(zhì)粒。其余報(bào)告基因質(zhì)粒是本實(shí)驗(yàn)室告基因質(zhì)粒購(gòu)自Ｐｒｏｍｅｇａ公司，其詳細(xì)質(zhì)粒構(gòu)架圖ＳＶ４０ｐｏ＾Ａ，邐，捕＿逡逑．Ｐｍｏｌ邋（４７６）逡逑如撕，邐丨邐．丨（？？咐逡逑：．邋一逡逑？－Ｓａｄ＿逡逑Ｓｐ？Ｊ邋（Ｓ２Ｓ）逡逑

圖２．１．３邋ｐＲＬ－ＴＫ－Ｒｅｎｉｌｌａ質(zhì)粒骨架圖譜逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１．３邋ｐＲＬ－ＴＫ－Ｒｅｎｉｌｌａ邋ｖｅｃｔｏｒ邋ｍａｐ逡逑桿菌感受態(tài)購(gòu)買(mǎi)自ＴＡＫＡＲＡ公司；單核李斯特菌劑盒（離心柱式）購(gòu)買(mǎi)自Ａｘｙｇｅｎ公司；去內(nèi)毒素買(mǎi)自Ｏｍｅｇａ公司。逡逑回收試劑盒和ＰＣＲ產(chǎn)物純化試劑盒均購(gòu)買(mǎi)自ＡｘｙＲ聚合酶ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ購(gòu)買(mǎi)自ＴＡＫＡＲＡ公司。逡逑酶邋ＢａｍＨ邋Ｉ、ＥｃｏＲ邋１、ＥｃｏＲ邋Ｖ、Ｘｈｏ邋Ｉ、Ｎａｅｌ邋和邋Ｈｉ合酶（２＞＜ＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ邋（Ｄｙｅ））購(gòu)買(mǎi)自康為世
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R392

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