【摘要】：巨噬細胞(macrophage)在固有免疫中發(fā)揮重要作用,受到病原菌刺激后產(chǎn)生多種與炎癥相關細胞因子和趨化因子,調(diào)控炎癥的進程。同時,巨噬細胞具有強大的吞噬能力,抗原提呈能力,能夠直接吞噬、殺傷入侵病原菌,從而在調(diào)控固有免疫和適應性免疫的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。目前的研究證實,巨噬細胞是一類異質(zhì)性的免疫細胞,具有較強的可塑性,能對環(huán)境信號作出有效反應,并根據(jù)刺激信號改變表型和生理功能,對病原體引起的炎癥發(fā)生和消退至關重要。一般認為巨噬細胞主要分為兩類,一類是經(jīng)典活化的巨噬細胞(classically activated macrophage),也稱之為M1,是一群促炎性的巨噬細胞;另一種是選擇性活化的巨噬細胞(alternatively activated macrophage),也稱之為M2,是一群抑炎性的巨噬細胞。巨噬細胞不同的細胞表型,在應對不同的微環(huán)境時能夠發(fā)揮不同的生理功能,以調(diào)控整個免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)。MEF2C是MEF2家族中重要的一員。作為特異性的轉(zhuǎn)錄因子,MEF2C在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、心臟形態(tài)發(fā)生、肌細胞分化中起到重要的作用。近年來研究證實MEF2C在炎癥和T/B淋巴細胞的發(fā)育等免疫相關生理病理狀態(tài)中也起到重要作用。本研究中,我們首先用siRNA干擾巨噬細胞MEF2C基因表達,LPS刺激后發(fā)現(xiàn)IL-12、IL-23、iNOS等M1細胞的分子標志(marker)表達顯著下調(diào),而IL-10、Arg-1等M2細胞的分子標志(marker)表達升高,過表達實驗得出相一致的結(jié)果。同時,我們誘導培養(yǎng)M1和M2巨噬細胞,RT-PCR和WB檢測發(fā)現(xiàn)MEF2C在M1細胞中高表達,而在M2細胞中低表達,以上結(jié)果提示MEF2C可能在巨噬細胞極化中起重要作用。利用新構(gòu)建的巨噬細胞MEF2C特異性敲除的小鼠,通過流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)巨噬細胞MEF2C缺陷,其M1 marker CD11c表達明顯下調(diào),而M2 marker CD206表達明顯升高。在LPS體內(nèi)誘導的炎癥模型和李斯特菌感染模型中,RT-PCR等檢測發(fā)現(xiàn)MEF2C缺陷的巨噬細胞表型與體外結(jié)果一致。在李斯特菌感染模型中,我們發(fā)現(xiàn)巨噬細胞MEF2C缺陷的小鼠在脾和肝等臟器內(nèi)李斯特菌的載量比對照組明顯增多,且巨噬細胞MEF2C缺陷的小鼠肝臟損傷也更嚴重;感染致死劑量李斯特菌后,MEF2C缺陷組死亡率高于對照組。同時,體外實驗發(fā)現(xiàn)巨噬細胞MEF2C缺陷殺傷李斯特菌的能力也明顯減弱。體外T細胞分化實驗表明,巨噬細胞MEF2C缺陷LPS刺激收取的上清,誘導Naive CD4T細胞分化為Th1細胞能力明顯減弱。分子機制上,我們通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪虲hIP實驗證實,MEF2C可以直接結(jié)合到IL-12和IL-10的啟動子上調(diào)控其基因的轉(zhuǎn)錄。綜上所述,我們實驗證實,MEF2C通過調(diào)控IL-12/IL-10基因的表達,從而調(diào)控巨噬細胞的極化和Th1細胞反應,進而調(diào)控機體的固有免疫和適應性免疫應答。
【圖文】：

圖２．１．１邋ｐＣＭＶ－Ｔａｇ－２Ｂ質(zhì)粒骨架圖譜逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１．１邋ｐＣＭＶ－Ｔａｇ－２Ｂ邋ｖｅｃｔｏｒ邋ｍａｐ逡逑酶報告基因系統(tǒng)包含２個熒光素酶報告基因質(zhì)粒，分ｐＭＩＲ－ＲＥＰＯＲＴＴＭ邋Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ邋和邋ｐＲＬ－ＴＫ－Ｒｅｎｉｌｌａ邋對、ＩＬ－１２ｐ４０亞基和ＩＬ－１０基因的ｐｒｏｍｏｔｏｒ序列均插入３－ＲＥＰＯＲＴＴＭ邋Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ的多克隆位點，，從而構(gòu)建－１０的報告基因質(zhì)粒。其余報告基因質(zhì)粒是本實驗室告基因質(zhì)粒購自Ｐｒｏｍｅｇａ公司，其詳細質(zhì)粒構(gòu)架圖ＳＶ４０ｐｏ＾Ａ，邐，捕＿逡逑．Ｐｍｏｌ邋（４７６）逡逑如撕，邐丨邐．丨（？？咐逡逑：．邋一逡逑？－Ｓａｄ＿逡逑Ｓｐ？Ｊ邋（Ｓ２Ｓ）逡逑

圖２．１．３邋ｐＲＬ－ＴＫ－Ｒｅｎｉｌｌａ質(zhì)粒骨架圖譜逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１．３邋ｐＲＬ－ＴＫ－Ｒｅｎｉｌｌａ邋ｖｅｃｔｏｒ邋ｍａｐ逡逑桿菌感受態(tài)購買自ＴＡＫＡＲＡ公司；單核李斯特菌劑盒（離心柱式）購買自Ａｘｙｇｅｎ公司；去內(nèi)毒素買自Ｏｍｅｇａ公司。逡逑回收試劑盒和ＰＣＲ產(chǎn)物純化試劑盒均購買自ＡｘｙＲ聚合酶ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ購買自ＴＡＫＡＲＡ公司。逡逑酶邋ＢａｍＨ邋Ｉ、ＥｃｏＲ邋１、ＥｃｏＲ邋Ｖ、Ｘｈｏ邋Ｉ、Ｎａｅｌ邋和邋Ｈｉ合酶（２＞＜ＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ邋（Ｄｙｅ））購買自康為世
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R392

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