【摘要】：松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)是松材線蟲病(pine wilt disease,PWD)的致病因子。目前,松材線蟲病在我國嚴重發(fā)生,造成巨大的經(jīng)濟損失。前期研究發(fā)現(xiàn),藍光能夠顯著地抑制松材線蟲胚胎發(fā)育,進一步研究發(fā)現(xiàn),藍光處理后許多基因在松材線蟲胚胎中的表達量下調(diào),其中W03G11.3基因的表達量顯著降低。在前期研究的基礎(chǔ)上,本文以松材線蟲和模式線蟲秀麗隱桿線蟲為研究對象,研究W03G11.3基因在兩種線蟲中的表達特性和調(diào)控功能;采用Semi Quantitative PCR方法分析W03G11.3基因在兩種線蟲整個生命周期中表達量的變化;構(gòu)建W03G11.3基因質(zhì)粒表達載體,采用轉(zhuǎn)基因顯微注射和in situ組織原位雜交技術(shù),分析其時空動態(tài)表達特性;采用RNAi技術(shù)研究該基因在兩種線蟲個體發(fā)育過程中的調(diào)控功能。具體研究結(jié)果如下:1、Semi Quantitative PCR結(jié)果表明,W03G11.3基因在松材線蟲和秀麗隱桿線蟲個體發(fā)育的各個階段都有表達。在松材線蟲中胚胎期到2齡期表達量穩(wěn)定,3齡期表達量明顯升高,3齡期到成蟲期表達量保持穩(wěn)定,同時雄性成蟲和雌性成蟲之間無差異表達;相比松材線蟲,秀麗隱桿線蟲胚胎期到成蟲期表達量趨于穩(wěn)定,但在雌雄同體的個體和雄性個體之間表現(xiàn)出差異表達,雌雄同體個體中表達量更高。2、in-situ原位雜交結(jié)果表明,W03G11.3基因在松材線蟲胚胎早期桑葚期體壁肌肉前體細胞中表達,當胚胎發(fā)育至逗號期,則在幼蟲體壁肌肉表達;從幼蟲期到成蟲期在松材線蟲體壁肌肉和腸道中穩(wěn)定表達。3、轉(zhuǎn)基因顯微注射研究結(jié)果表明,W03G11.3基因在秀麗隱桿線蟲胚胎早期逗號期開始表達,從胚胎期到成蟲期表達穩(wěn)定,主要集中在體壁肌肉、尾部泄殖腔控制肌肉和腸腔肌肉中表達,同時還在成蟲子宮內(nèi)部平滑肌中表達。4、RNAi結(jié)果表明,W03G11.3基因表達受雙鏈RNA干擾后,松材線蟲30h內(nèi)胚胎孵化率,由正常的85.36%降至50.07%,影響線蟲肌肉的正常發(fā)育,同時2齡期和成蟲期線蟲20 s內(nèi)頭部擺動頻率,干擾后由正常的16.5、20.1次降至2.3、7.3次,線蟲出現(xiàn)嚴重的運動缺陷;成蟲12h內(nèi)產(chǎn)卵量,由正常的13.7顆降至2.8顆,雌蟲產(chǎn)卵數(shù)量顯著減少,同時導(dǎo)致線蟲壽命縮短;相比之下秀麗隱桿線蟲胚胎孵化率雖有所下降,但不顯著,而成蟲12h內(nèi)產(chǎn)卵量由正常的9.3顆降至3.9顆,產(chǎn)卵總數(shù)顯著降低。上述研究結(jié)果不僅明確了W03G11.3基因在松材線蟲和秀麗隱桿線蟲的時空動態(tài)表達特性和對個體發(fā)育的調(diào)控功能,也為揭示藍光抑制松材線蟲和秀麗隱桿線蟲胚胎發(fā)育并導(dǎo)致種群數(shù)量減少的內(nèi)在原因提供理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

3 結(jié)果與分析松材線蟲和秀麗隱桿線蟲W03G11.3基因生物信息學(xué)分析使用 emboss pairwise序列分析 W03G11.3 基因，發(fā)現(xiàn)與人體內(nèi) α-L-巖藻糖具有 41.7 ％同一性和 57.5 ％相似性（圖 1A）；但與禾谷鐮刀菌 GH95 家-L-巖藻糖苷酶僅有 20％的同一性和 33％的相似性（圖 1B）。比對結(jié)果表W03G11.3 基因?qū)儆?GH92 家族α-L-巖藻科并且功能相似。 此外，序列分揭示了松材線蟲和秀麗隱桿線蟲 W03G11.3 基因中的潛在信號肽，表明G11.3 基因是潛在的分泌蛋白（圖 1A）。為了分析與其他物種的進化關(guān)系具有完整蛋白質(zhì)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，以表明α-L-巖藻糖苷酶存在線蟲特異歧（圖 1C）。此外，還觀察到其他 6 個分支，包括 Chordata，Arthropodrthropada，Nematoda，Bacteria 和 Fungi（圖 1C），反映出不同門之間的進系。

圖 2松材線蟲RNA電泳結(jié)果ectrophoresis results of Bursaphe轉(zhuǎn)錄松材線蟲混蟲RNA反轉(zhuǎn) Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)260/280 為 1.80，260/230 為.3 基因編碼區(qū)獲取線蟲 W03G11.3 基因編碼60/280 為 1.90，260/230
【學(xué)位授予單位】：浙江農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S763.7;Q953

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 何龍喜;吉靜;邱秀文;張林平;;世界松材線蟲病發(fā)生概況及防治措施[J];林業(yè)科技開發(fā);2014年03期

2 陳守常;;松材線蟲病病原與致病機理研究進展[J];四川林業(yè)科技;2010年01期

3 寧眺,方宇凌,湯堅,孫江華;松材線蟲及其傳媒松墨天牛的監(jiān)測和防治現(xiàn)狀[J];昆蟲知識;2005年03期

，

本文編號：2645862