發(fā)布時間：2020-04-28 08:26

【摘要】：LIS1(Lissencephaly 1,也叫PAFAH1B1)對于動力蛋白Dynein所介導(dǎo)的胞內(nèi)物質(zhì)運輸及高爾基體、胞內(nèi)體、溶酶體和線粒體的正確定位是必需的。Lisl基因也是第一個被確認(rèn)與神經(jīng)元遷移疾病有關(guān)的基因,它在人體中的雜合缺失會導(dǎo)致嚴(yán)重的大腦畸形疾病,該疾病主要表現(xiàn)為腦回的缺失,灰質(zhì)體積的增加以及白質(zhì)體積的減少,因而稱之為無腦回畸形疾病。近幾年來,對于Lisl基因的功能研究主要集中在大腦神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育以及無腦回疾病致病機(jī)理上,而對于Lisl基因在其他組織器官發(fā)育中的功能知之甚少。為了探究Lisl基因在組織器官發(fā)育過程中的相關(guān)功能,我們分別建立了肺上皮細(xì)胞Lisl基因特異性敲除小鼠模型以及四肢間充質(zhì)細(xì)胞Lisl基因特異性敲除小鼠模型。通過對E18.5的小鼠胚胎的表型分析,我們發(fā)現(xiàn)Lis1 KO小鼠胚胎肺和四肢未形成。對小鼠早期胚胎肺和四肢進(jìn)行TUNEL以及pHH3染色,我們發(fā)現(xiàn)Lisl KO小鼠胚胎肺上皮細(xì)胞和四肢間充質(zhì)細(xì)胞中存在大量的細(xì)胞凋亡,而細(xì)胞增殖卻與對照小鼠無差異。進(jìn)一步通過對小鼠胚胎進(jìn)行原位雜交實驗,我們發(fā)現(xiàn)FGF信號通路下游靶基因在Lisl KO小鼠胚胎肺和四肢中的表達(dá)位置存在異常,并且其表達(dá)強(qiáng)度也低于對照小鼠。此外,對E10.5時期Lisl KO小鼠前肢進(jìn)行RNA Seq測序分析,我們發(fā)現(xiàn)Lisl基因的敲除的確會影響FGF信號通路的正確轉(zhuǎn)導(dǎo)。與此同時,通過利用KrasLSL-Gl2D/+轉(zhuǎn)基因小鼠模型來激活FGF信號通路下游的MAPK信號通路,我們發(fā)觀ShhCre;Lislf/f;KrasLSL-Gl2D/+以及Prxl Cre;Lislf/f;Kras LSL-Gl2D/+小鼠胚胎肺和四肢的發(fā)育缺陷會得到部分的修復(fù)。這個結(jié)果進(jìn)一步說明Lisi KO小鼠的肺與四肢中FGF信號通路被抑制。為了在細(xì)胞及分子水平研究Lis1基因如何調(diào)控FGF信號通路,我們分離并建立了永生化的Lislf/f MEF(小鼠胚胎成纖維)細(xì)胞,在細(xì)胞水平上進(jìn)一步驗證發(fā)現(xiàn)當(dāng)Lisl基因在MEF細(xì)胞中被敲除后,FGF信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)會出現(xiàn)阻滯。通過免疫共沉淀實驗,我們發(fā)現(xiàn)LIS1及其相互作用蛋白NDE1/NDEL1與FGF受體在體內(nèi)存在一定的相互作用。并且,免疫熒光以及Western Blotting實驗結(jié)果也顯示LIS1能夠調(diào)控FGF受體在胞內(nèi)的定位以及蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。值得注意的是,FGF信號通路的激活還能促進(jìn)NDE1酪氨酸磷酸化,隨后,進(jìn)一步導(dǎo)致LIS1/NDE1復(fù)合物發(fā)生解離。因此,我們的研究結(jié)果表明,LIS1對于小鼠胚胎肺和四肢的正常發(fā)育至關(guān)重要。并且,我們的研究也確定了LIS1/NDE1復(fù)合物是FGF信號通路的一個重要調(diào)節(jié)因子,為FGF受體在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運機(jī)制和內(nèi)吞作用的雙向調(diào)節(jié)提供了新的見解,更重要的是,我們的研究也為闡明LIS1/NDE1突變所導(dǎo)致相關(guān)遺傳疾病的分子機(jī)制提供了一個新的方向。
【圖文】：

浙江大學(xué)博士學(xué)位論文邐引言逡逑遷移，其成體層組織依舊正常。若ＬＩＳ１蛋白的表達(dá)劑量過低，則會阻塞大腦皮質(zhì)逡逑和海馬組織的正常發(fā)育［２０－２２］。這種情況下，不僅大腦組織發(fā)育會受影響，而且運逡逑動能力、學(xué)習(xí)能力和記憶能力都會相應(yīng)的下降［２３］。當(dāng)Ｌｂ／基因處于亞效等位基因逡逑狀態(tài)時，會出現(xiàn)大腦神經(jīng)元遷移短暫抑制，神經(jīng)元細(xì)胞分裂異常，大腦膠質(zhì)細(xì)胞形逡逑態(tài)呈放射狀，以及地中海運動皮層的神經(jīng)支配延遲等現(xiàn)象［２４－２６］。由于絕大多數(shù)無逡逑腦回疾病患者也存在中間神經(jīng)元的切向遷移異常Ｐ７］，，與此類似的發(fā)育缺陷可能也逡逑是導(dǎo)致無腦回疾病患者vr癇發(fā)作的原因之一。逡逑

腦回疾病患者也存在中間神經(jīng)元的切向遷移異常Ｐ７］，與此類似的發(fā)育缺陷可能也逡逑是導(dǎo)致無腦回疾病患者vr癇發(fā)作的原因之一。逡逑圖１．１無腦回疾病患者大腦核磁共振圖［２８］。圖中顯示了邋５例與ＬＩＳ１相關(guān)的無腦回畸形患者逡逑的軸位腦掃描圖像，按照疾病的嚴(yán)重程度可分為６個等級。１顯示完全的無腦回，２ａ顯示彌漫逡逑性無腦回，３ａ顯示腦后部無腦回且額巨腦回，４ａ顯示彌漫性或部分肥厚性腦回，６ａ顯示腦皮逡逑層下帶異位。逡逑１．１．２邋ＬＩＳ１的蛋白結(jié)構(gòu)及其相關(guān)生理功能逡逑基因位于人類１７號染色體１７ｐｌ３．３區(qū)域［１１］，長度約為９２ｋｂ，包含１１個逡逑外顯子，編碼含４１０個氨基酸的ＬＩＳ１蛋白。ＬＩＳ］蛋白包含兩個結(jié)構(gòu)域，這兩個結(jié)逡逑構(gòu)域?qū)τ冢蹋桑樱钡鞍椎亩刍鹬浅Ｖ匾淖饔茫郏玻梗常保�。ＬＩＳ１蛋白Ｎ端由一個逡逑ＬｉｓＨ結(jié)構(gòu)域和一個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域組成。而ＬＩＳ１蛋白的Ｃ端則主要是由７個ＷＤ逡逑重復(fù)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，這些重復(fù)結(jié)構(gòu)域?qū)τ冢蹋桑樱钡鞍着c其他蛋白的相互作用起到十分逡逑重要的作用Ｐ２］。經(jīng)生化純化分析后，基因編碼的蛋白產(chǎn)物被鑒定為血小板活逡逑化因子乙酰水解酶的調(diào)節(jié)亞單位［３３］。血小板活化因子乙酰水解酶是一種由ＬＩＳＩ逡逑２逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q344

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本文編號：2643259