【摘要】：各種各樣的病原微生物(細(xì)菌、真菌和病毒等)對機(jī)體的生長、發(fā)育和繁殖等過程造成潛在威脅。免疫系統(tǒng)是機(jī)體防御病原微生物入侵的有效武器,主要包括先天性免疫(innate immunity)與適應(yīng)性免疫(adaptive immunity)。相對于先天免疫,適應(yīng)性免疫反應(yīng)一般在微生物等抗原物質(zhì)刺激后誘發(fā),并能與該抗原起特異性反應(yīng)。其中,主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)作為抗原提呈分子參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答,主要識別經(jīng)樹突細(xì)胞或巨噬細(xì)胞等處理后的抗原,并提呈給T細(xì)胞抗原受體(T cell receptor,TCR)激活T細(xì)胞以啟動細(xì)胞免疫,最終釋放細(xì)胞因子消滅抗原或者致使被感染細(xì)胞發(fā)生裂解。另外,免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)是適應(yīng)性免疫中另一類重要的作用分子,介導(dǎo)體液免疫,可直接與游離抗原特異性結(jié)合以發(fā)揮免疫效應(yīng)。在哺乳動物進(jìn)化過程中,不同進(jìn)化譜系具有不同生境、食性以及集群行為等。其中,鯨類是一類特化的水生哺乳動物,其陸生祖先從陸地重返海洋,這種特殊的進(jìn)化歷史為研究生境轉(zhuǎn)換、食性轉(zhuǎn)變引起的免疫適應(yīng)機(jī)制提供理想模型。然而,是否這些生態(tài)因子的不同引起病原微生物差異,從而驅(qū)動不同哺乳動物進(jìn)化譜系免疫系統(tǒng)的適應(yīng)尚不清楚。因此,本研究以適應(yīng)性免疫基因MHC、TCR和Ig基因家族為候選基因,從鯨類MHC與TCR的基因組結(jié)構(gòu),家族成員系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系探究為基礎(chǔ),拓展到哺乳動物TCR和Ig基因數(shù)目進(jìn)化及分子進(jìn)化速率與生態(tài)因子(生境、食性與集群行為等)的相關(guān)性研究,以期揭示驅(qū)動TCR和Ig進(jìn)化的主要生態(tài)因子并系統(tǒng)地為免疫基因家族在不同生態(tài)位下的進(jìn)化機(jī)制提供分子遺傳基礎(chǔ)。MHC基因家族(包括I、II和III類基因)是目前發(fā)現(xiàn)的脊椎動物基因組中多態(tài)性最高的一類基因群。其中,MHC II類基因在種間具有較高同源性,且其主要負(fù)責(zé)識別與提呈外源性抗原,包括各種非己成分,如細(xì)菌產(chǎn)生的毒素。因此,MHC II類基因的進(jìn)化更能反應(yīng)機(jī)體對外界環(huán)境的免疫防御能力。為了探究鯨類生境轉(zhuǎn)變過程中其MHC II類基因的進(jìn)化模式,本研究對7種鯨類代表性物種的基因組掃描10個MHC II類基因座位(DRA、DRB、DQA、DQB、DPA、DPB、DOA、DOB、DMA和DMB),共鑒定了76條基因序列。在10個基因座位中,DPA座位在鯨類中已經(jīng)丟失,而DPB座位在7種鯨類中均只保留了部分編碼片段,剩余的8個座位在鯨類中保留完整基因序列,除了DRB為多拷貝(2-4個拷貝)外,其余均為單拷貝。這些成功鑒定的基因座位在鯨類中的基因排布與其陸生近緣物種牛和羊相似,均表現(xiàn)為MHC IIa和IIb兩個亞區(qū)域。然而,部分座位(DQA、DQB與DRB)的基因拷貝數(shù)與陸生動物存在差異,比如DRB在鯨類中為2-4個拷貝,但在陸生物種中為3-6個拷貝。將多拷貝座位DRB的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育重建,DRB1與DRB2支系位于拓?fù)渥顑?nèi)部且僅含有鯨類序列,推測這兩個基因是鯨類與偶蹄類分化后在適應(yīng)水生生活過程中復(fù)制產(chǎn)生的新基因,這可能是受水生環(huán)境獨(dú)特病原體驅(qū)動的結(jié)果。其中2/5的DRB2轉(zhuǎn)變?yōu)榧倩?1/2的DRB1在小須鯨中新復(fù)制產(chǎn)生。以上拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)提示鯨偶蹄類DRB基因進(jìn)化模式符合“生滅模型”(birth-and-death model)。在細(xì)胞免疫反應(yīng)鏈中,TCR位于MHC下游,結(jié)合由MHC提呈的抗原激活T細(xì)胞進(jìn)而產(chǎn)生免疫反應(yīng)。根據(jù)肽鏈組成不同,TCR分為αβTCR和γδTCR,前者結(jié)合MHC提呈的抗原,后者可直接結(jié)合原始抗原。因此,γδTCR編碼基因(TRG和TRD基因)的遺傳進(jìn)化更能反應(yīng)鯨類生境轉(zhuǎn)變過程中的免疫適應(yīng)。我們在8種代表性鯨類基因組掃描TRG和TRD的所有胚系基因,包括可變區(qū)基因(variable,V)、連接區(qū)基因(joining,J)、多樣性基因(diversity,D)和恒定區(qū)基因(constant,C),共成功鑒定158條基因序列。其中TRG基因共有72條完整基因序列,包括38個TRGV、26個TRGJ和8個TRGC基因。此外,TRGC基因還鑒定到5個單獨(dú)的外顯子片段。TRD基因共有86個完整基因,包括31個TRDV、22個TRDD、25個TRDJ和8個TRDC基因。與牛和羊類似,鯨類TRG和TRD基因的基因組結(jié)構(gòu)分別呈V-J-C和V-D-J-C-V排布。系統(tǒng)發(fā)育重建提示鯨類TRG和TRD基因的分化早于其與偶蹄類的分化。運(yùn)用系統(tǒng)發(fā)生相關(guān)性分析(Phylogenetic generalized least squares,PGLS)進(jìn)一步探究鯨偶蹄目物種TRGV和TRDV基因數(shù)目進(jìn)化與生境的關(guān)系,結(jié)果表明TRGV基因和TRDV基因數(shù)目與生境存在顯著相關(guān)性(TRGV:R~2=0.398,p=0.007;TRDV:R~2=0.427,p=0.004)。為了進(jìn)一步探討是否整個哺乳動物譜系TCR基因數(shù)目進(jìn)化受環(huán)境因子影響,我們選取37種代表性哺乳動物,探究TCR恒定區(qū)基因(TRC:TRAC、TRBC、TRGC和TRDC)和可變區(qū)基因(TRV:TRAV、TRBV、TRGV和TRDV)的進(jìn)化與3種生態(tài)因子(生境、食性和集群行為)之間的關(guān)系。首先運(yùn)用系統(tǒng)發(fā)育方差分析(phyANOVA)對TRC數(shù)目在3種生態(tài)因子的不同組間比較,結(jié)果表明TRC基因數(shù)目在4種生境分組(半水生、水生、陸生、飛行)間存在顯著差異(p=0.030),這種差異主要由TRGC基因數(shù)目在水生與半水生組間的顯著差異(水生組vs.半水生組:1.5560 vs.5.400,p=0.006)以及飛行與半水生組間的顯著差異(飛行組vs.半水生組:1.21 vs.5.400,p=0.006)引起。并且,生境越復(fù)雜的哺乳動物(如半水生生境的物種),比僅占有一種生境的物種(如水生或陸生物種)傾向于擁有更多的TRGC數(shù)目。類似地,PGLS分析結(jié)果提示TRGC數(shù)目與生境存在顯著相關(guān)性(R~2=0.304,p0.001)。以上結(jié)果表明哺乳動物TRC數(shù)目進(jìn)化顯著受生境影響。分子進(jìn)化分析結(jié)果表明TRAC和TRDC基因進(jìn)化速率(ω)在特定生態(tài)位類群中存在相反的趨勢:以生境為例,TRAC:ω_(水生)ω_(飛行)ω_(陸生)ω_(半水生);TRDC:ω_(半水生)ω_(陸生)ω_(飛行)ω_(水生)。以上結(jié)果提示,不同哺乳動物TRC基因免疫適應(yīng)的策略可能主要是在增加TRGC基因家族數(shù)目與調(diào)諧TRAC和TRDC基因分子進(jìn)化速率之間保持權(quán)衡。類似地,在3種生態(tài)因子(生境、食性與集群行為)中,TRV基因數(shù)目在生境與食性兩種生態(tài)因子不同組間存在顯著差異(p0.05)。其中,TRAV基因數(shù)目在不同生境組間具有顯著差異(p=0.027),主要由水生組與陸生組間顯著差異引起(水生組vs.陸生組:16.250 vs.64.222,p=0.030)。然而,TRBV數(shù)目在不同食性組間具有顯著差異(p=0.011),該差異表現(xiàn)在食肉組與食草組之間(食肉組vs.食草組:11.167 vs.42.400,p=0.010)。PGLS結(jié)果進(jìn)一步揭示TRAV和TRBV數(shù)目與生境、食性顯著相關(guān)(R~20.13,p0.05)。以上結(jié)果提示生境與食性轉(zhuǎn)變引起的病原微生物差異影響TRAV與TRBV數(shù)目改變。αβT細(xì)胞為大部分物種體內(nèi)最主要的T細(xì)胞群,主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫、輔助體液免疫及參與免疫調(diào)節(jié)。本研究中,αβTCR的V基因(TRAV和TRBV)數(shù)目在生境和食性組間的差異以及相關(guān)性表明二者的數(shù)目進(jìn)化受到生境與食性影響,同時也提示αβTCR在不同生境與食性哺乳動物免疫適應(yīng)中的關(guān)鍵作用。另一方面,TRGV的基因數(shù)目不僅在群居與獨(dú)居物種間差異顯著(p=0.001),并且該數(shù)目與集群行為具有顯著相關(guān)性(R~20.160,p0.050)。此外,TRDV基因數(shù)目與生境也顯著相關(guān)(R~20.130,p0.050)。以上結(jié)果表明TRGV和TRDV數(shù)目進(jìn)化受到生境與集群行為二者的影響。盡管大部分哺乳動物外周血中γδT細(xì)胞含量較少,但其兼具先天性免疫與適應(yīng)性免疫特性,在應(yīng)對感染性疾病,創(chuàng)傷修復(fù)以及維持組織穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用。本研究中檢測到編碼γδTCR的TRDV、TRGC和TRGV基因數(shù)目分別與生境和集群行為具有顯著相關(guān)性,提示γδT細(xì)胞在不同生境和集群行為哺乳動物免疫適應(yīng)中占有重要地位。為了進(jìn)一步探究細(xì)胞免疫的抗原受體TCR進(jìn)化是否受到上游配體MHC的影響,運(yùn)用PGLS分析哺乳動物MHC與TCR多樣性之間的進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRAV和TRBV數(shù)目與DQB等位基因數(shù)目之間均存在顯著正相關(guān)關(guān)系(TRAV~DQB:R~2=0.373,p=0.027;TRBV~DQB:R~2=0.311,p=0.048),提示MHC與TCR存在協(xié)同進(jìn)化。MHC豐富的多態(tài)性被部分學(xué)者認(rèn)為是通過病原介導(dǎo)的平衡選擇所維持,并且瀕危物種通常具有較低的MHC多態(tài)性。TCR作為MHC下游受體,其龐大的分子多樣性賦予個體對環(huán)境中數(shù)量眾多、易于突變的病原體進(jìn)行識別和應(yīng)答的巨大潛力。本研究檢測到MHC與TCR的協(xié)同進(jìn)化模式表明機(jī)體MHC與TCR在應(yīng)對環(huán)境抗原過程中相互影響,共同促進(jìn)機(jī)體的免疫適應(yīng)能力。為了進(jìn)一步系統(tǒng)地探究影響適應(yīng)性免疫抗原受體數(shù)目進(jìn)化的主要生態(tài)因子,我們選取T細(xì)胞受體可變區(qū)基因家族(TRV)和免疫球蛋白可變區(qū)基因家族(IGV)在79種代表性哺乳動物中檢測二者的進(jìn)化與3種生態(tài)因子(生境、食性、集群行為)的關(guān)系。phyANOVA結(jié)果顯示,TRAV基因家族數(shù)目在不同生境組間具有顯著差異(p=0.016),該差異主要由水生與陸生組間差異引起(水生組vs.陸生組:15.889 vs.57.725,p=0.006)。但不同食性組間TRBV基因數(shù)目的差異(p=0.006)主要表現(xiàn)為食肉與食草組間顯著差異(食肉組vs.食草組:13.350 vs.35.230,p=0.010)。此外,PGLS分析檢測到TRDV基因家族數(shù)目與生境之間存在微弱相關(guān)性(R~2=0.050,p=0.047)。另一方面,IGV基因數(shù)目與生態(tài)位之間并沒有檢測到顯著的相關(guān)性(p0.05),提示IGV進(jìn)化可能受其他生態(tài)因子影響或者存在其他的進(jìn)化模式,比如通過不同胚系基因排列多樣化以及免疫球蛋白亞型多樣性以產(chǎn)生免疫適應(yīng),尚需進(jìn)一步深入研究。綜上,生境與食性是影響哺乳動物抗原受體數(shù)目進(jìn)化的主要生態(tài)因子。生境與食性差異帶來的病原差異驅(qū)動抗原受體進(jìn)化產(chǎn)生免疫適應(yīng),使機(jī)體能夠應(yīng)對多變環(huán)境中的病原微生物。綜上,本論文以鯨類MHC與TCR家族基因組結(jié)構(gòu)探究為基礎(chǔ),揭示哺乳動物MHC與TCR基因組結(jié)構(gòu)在進(jìn)化過程中比較保守。TRC基因數(shù)目進(jìn)化受到生境影響,而TRV基因數(shù)目進(jìn)化則受到生境與食性的共同影響。不同進(jìn)化譜系哺乳動物TRC免疫適應(yīng)的策略為權(quán)衡TRGC和TRAV基因數(shù)目與TRAC正選擇強(qiáng)度以及平衡TRAC和TRDC基因進(jìn)化速率。此外,TCR與MHC的協(xié)同進(jìn)化提示二者在應(yīng)對環(huán)境抗原過程中相互影響,共同促進(jìn)機(jī)體的免疫適應(yīng)能力。本研究為哺乳動物對不同環(huán)境的免疫適應(yīng)提供了系統(tǒng)的分子基礎(chǔ),為深入理解適應(yīng)性免疫基因家族進(jìn)化提供了新的思路。
【圖文】：

3.1 后口動物中免疫系統(tǒng)進(jìn)化概覽（該圖引自[13]）。1R 和 2R 表示兩輪全基因組鰭魚綱的祖先在約 3.2 億年前被認(rèn)為經(jīng)歷了一次額外的、支系特異的全基因組復(fù)re 1.1 Overview of the evolution of the immune system in deuterostomes (source:[13]dicate the two rounds of whole-genome duplication (WGD).An ancestor of the majofinned fish is thought to have experienced an additional, lineage-specific WGD (desi3R) ~320 million years ago.

圖 1.2 MHC I 類和 II 類分子結(jié)構(gòu)示意圖（該圖引自[2Figure 1.2 Structural schematic of class I and class II MHC moleculHC 多態(tài)性C 多態(tài)性主要源于其經(jīng)典基因的大量等位基因（allele）數(shù)于一對同源染色體的相同位置上控制相對性狀的一對基因，中的變異。通常情況下，每個個體的任一個座位均含有兩個和母親。若這些等位基因均能表達(dá)，則稱為共顯性（co-do機(jī)婚配使得來自父母的兩條第 6 號染色體上所有 HLA 基因使得 HLA 成為人體中多態(tài)性最豐富的系統(tǒng)。MHC 的豐富以適應(yīng)多變的內(nèi)外環(huán)境，，保證種群能夠作出應(yīng)對各類病原體體的延續(xù)、維持與穩(wěn)定性。截至 2006 年 7 月，HLA-A、H位基因數(shù)分別為 478、805 和 256[21]。II 類基因中，B 基因A-DRA1、HLA-DQA1 和 HLA-DPA1 的等位基因數(shù)分別為 基因的等位基因分別為 527、73 和 125[16, 21]。
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q953

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本文編號：2638896