【摘要】：褪黑素是動植物體內重要的吲哚類信號物質,在植物中起著重要的作用。植物可以感知UV-B輻射,進而通過信號轉導調節(jié)生長發(fā)育或者抵御傷害。為了研究植物褪黑素在UV-B脅迫中的作用及三個褪黑素合成酶在整個生命周期的功能,本研究首先成功獲得擬南芥褪黑素合成酶ASMT(N-acetylserotonin methyltransferase)和COMT(caffeic acid O-methyltransferase)的過表達植株以及SNAT(Serotonin N-acetyltransferase)過表達植株SNAT1-OE、SNAT3-OE(不同剪切本),同時篩選出SNAT的T-DNA插入突變體株系SALK_032239,以及三種褪黑素合成酶Pro_(SNAT)::GUS、Pro_(COMT)::GUS和Pro_(ASMT)::GUS轉基因株系。通過組織化學染色和qRT-PCR技術對擬南芥褪黑素三個合成酶的時空表達特性進行分析;并且分別對SNAT1-OE、SNAT3-OE、Col-0和snat擬南芥采用UV-B輻射(313nm)處理,運用qRT-PCR技術分析褪黑素合成酶基因ASMT、COMT和SNAT相對表達量及UV-B信號通路基因和UV-B效應基因表達情況;利用ELISA實驗,檢測了轉基因植株在不同時間段處理下褪黑素的積累量;通過DAB(Diaminobenzidine)染色、NBT(Nitrotetrazolium blue)染色、H_2O_2含量檢測、丙二醛(MDA)含量檢測和電解質泄漏等生理實驗,闡明了褪黑素對長時間UV-B脅迫具有抵抗作用。主要研究成果如下:(1)通過組織化學染色和qRT-PCR技術對三個擬南芥褪黑素合成酶基因表達模式分析發(fā)現(xiàn),SNAT在擬南芥植株花器官和角果中表達量高;COMT不僅在擬南芥營養(yǎng)生長階段表達量高,而且在生殖生長階段表達量也很高;ASMT主要在根和花器官中表達。(2)為了研究褪黑素在UV-B脅迫中的作用,我們分別構建了pRI101-SNAT、pRI101-COMT和pRI101-ASMT植物雙元表達載體,通過凍融法將重組載體成功轉化至土壤農桿菌株GV3101,使用浸花法分別轉化擬南芥Col-0,通過抗性篩選和基因組DNA初步鑒定確定35S::ASMT轉基因植株16株、35S::COMT轉基因植株8株、35S::SNAT1轉基因植株20株、35S::SNAT3轉基因植株9株,說明外源DNA均成功插入到擬南芥Col-0基因組中。通過qRT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)大部分過表達植株的mRNA相對表達量遠大于Col-0;最后通過ELISA對過表達植株進行褪黑素含量檢測,結果顯示大多數(shù)轉基因過表達株系的褪黑素含量上升1.5-2倍。通過PCR實驗篩選得到SNAT純合突變體SALK_032239。選取AtSNAT的突變體和過表達轉基因植株進行表型觀察,Col-0的根長為4.6±0.16cm,snat的根長為3.47±0.25cm,SNAT1-OE與SNAT3-OE根長分別為5.2±0.17cm、5.3±0.13cm,這一結果表明,SNAT基因缺失導致根的生長受阻;SNAT基因過表達促進根的生長。在313nm UV-B輻射下,不同時間段分別處理SNAT的不同剪切本過表達株系SNAT1-OE、SNAT3-OE、Col-0和snat擬南芥。qRT-PCR結果表明,UV-B處理2h時,褪黑素合成酶基因SNAT、COMT、ASMT的mRNA相對表達量峰值遠大于Col-0或者snat;ELISA實驗結果發(fā)現(xiàn),UV-B處理4h時,SNAT1、SNAT3過表達植株褪黑素含量分別是Col-0增幅的1倍和2倍,是snat突變體的3倍和3.2倍。同時,在褪黑素合成酶SNAT、COMT和ASMT基因和褪黑素含量方面,SNAT3-OE植株的表達都比SNAT1-OE顯著。(3)我們通過qRT-PCR技術檢測了UV-B信號通路相關基因表達情況,結果表明,與Col-0植株相比,SNAT過表達植株中HY5(ELONGATED HYPOCOTYL 5)的相對表達量明顯上升,同時COP1(CONSTITUTIVELYPHOTOMORPHOGENIC 1)、HYH(HY5HOMOLOG)、RUP1(REPRESSOR OF UV-B PHOTOMORPHOGENESIS 1)和RUP2(REPRESSOR OF UV-B PHOTOMORPHOGENESIS 2)的相對表達量也明顯上升;snat突變體植株中HY5的相對表達量最小。實驗結果證明,SNAT基因可以影響UV-B信號通路,同時其下游效應基因APX(Ascorbate Peroxidase)、SAPX(Chloroplast APX)、CAT1(Catalase1)、CSD1(Cytosolic Superoxide Dismutase 1)的相對表達量提高,引發(fā)植物機體內ROS含量降低。DAB染色、NBT染色、H_2O_2含量測定結果表明在4h、6h時,過表達轉基因植株體內ROS含量少于Col-0和snat;MDA含量測定結果表明在4h、6h時,過表達轉基因植株體內MDA含量低于Col-0和snat;電解質泄露實驗結果表明在2h、4h、6h,過表轉基因植株的電導率值小于Col-0和snat。這些結果說明擬南芥體內褪黑素含量的增加提高了植株對于UV-B輻射的感知,并提高了抗性,同時SNAT的剪切本SNAT3-OE株系對于UV-B的抗性強于SNAT1-OE。
【圖文】：

第一章 緒論葉綠體，可能會以不同的模式影響褪黑素在植物中胺在衰老的水稻葉片中高含量積累，而色胺和 N-中通過 T5H 可快速將色胺轉化為 5-羥色胺，但 5-羥轉化緩慢，，所以 SNAT 也是合成途徑的限速酶。存成途徑在維持褪黑素穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，同時植誘導褪黑素的合成[37,38]。

圖 1-2 植物褪黑素合成的多種途徑[36]Fig.1-2 The multiple pathways of melatonin biosynthesis in plants[36].TDC，色氨酸脫羧酶；TPH，色氨酸羥化酶；T5H，色胺 5-羥化酶；SNAT，5-羥色胺SMT，乙酰 5-羥色胺甲基轉移酶；COMT，咖啡酸甲基轉移酶；ER，內質網。 1-3 擬南芥 SNAT 、COMT and ASMT 參與的褪黑素生物合成的概述[39]3 Overview of possible melatonin biosynthesis by SNAT 、COMT and ASMT in ArabidASMT/ASMT/ASMT
【學位授予單位】：西北大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q943.2

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