【摘要】：褪黑素是動(dòng)植物體內(nèi)重要的吲哚類信號(hào)物質(zhì),在植物中起著重要的作用。植物可以感知UV-B輻射,進(jìn)而通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育或者抵御傷害。為了研究植物褪黑素在UV-B脅迫中的作用及三個(gè)褪黑素合成酶在整個(gè)生命周期的功能,本研究首先成功獲得擬南芥褪黑素合成酶ASMT(N-acetylserotonin methyltransferase)和COMT(caffeic acid O-methyltransferase)的過(guò)表達(dá)植株以及SNAT(Serotonin N-acetyltransferase)過(guò)表達(dá)植株SNAT1-OE、SNAT3-OE(不同剪切本),同時(shí)篩選出SNAT的T-DNA插入突變體株系SALK_032239,以及三種褪黑素合成酶Pro_(SNAT)::GUS、Pro_(COMT)::GUS和Pro_(ASMT)::GUS轉(zhuǎn)基因株系。通過(guò)組織化學(xué)染色和qRT-PCR技術(shù)對(duì)擬南芥褪黑素三個(gè)合成酶的時(shí)空表達(dá)特性進(jìn)行分析;并且分別對(duì)SNAT1-OE、SNAT3-OE、Col-0和snat擬南芥采用UV-B輻射(313nm)處理,運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)分析褪黑素合成酶基因ASMT、COMT和SNAT相對(duì)表達(dá)量及UV-B信號(hào)通路基因和UV-B效應(yīng)基因表達(dá)情況;利用ELISA實(shí)驗(yàn),檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因植株在不同時(shí)間段處理下褪黑素的積累量;通過(guò)DAB(Diaminobenzidine)染色、NBT(Nitrotetrazolium blue)染色、H_2O_2含量檢測(cè)、丙二醛(MDA)含量檢測(cè)和電解質(zhì)泄漏等生理實(shí)驗(yàn),闡明了褪黑素對(duì)長(zhǎng)時(shí)間UV-B脅迫具有抵抗作用。主要研究成果如下:(1)通過(guò)組織化學(xué)染色和qRT-PCR技術(shù)對(duì)三個(gè)擬南芥褪黑素合成酶基因表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn),SNAT在擬南芥植株花器官和角果中表達(dá)量高;COMT不僅在擬南芥營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段表達(dá)量高,而且在生殖生長(zhǎng)階段表達(dá)量也很高;ASMT主要在根和花器官中表達(dá)。(2)為了研究褪黑素在UV-B脅迫中的作用,我們分別構(gòu)建了pRI101-SNAT、pRI101-COMT和pRI101-ASMT植物雙元表達(dá)載體,通過(guò)凍融法將重組載體成功轉(zhuǎn)化至土壤農(nóng)桿菌株GV3101,使用浸花法分別轉(zhuǎn)化擬南芥Col-0,通過(guò)抗性篩選和基因組DNA初步鑒定確定35S::ASMT轉(zhuǎn)基因植株16株、35S::COMT轉(zhuǎn)基因植株8株、35S::SNAT1轉(zhuǎn)基因植株20株、35S::SNAT3轉(zhuǎn)基因植株9株,說(shuō)明外源DNA均成功插入到擬南芥Col-0基因組中。通過(guò)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大部分過(guò)表達(dá)植株的mRNA相對(duì)表達(dá)量遠(yuǎn)大于Col-0;最后通過(guò)ELISA對(duì)過(guò)表達(dá)植株進(jìn)行褪黑素含量檢測(cè),結(jié)果顯示大多數(shù)轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)株系的褪黑素含量上升1.5-2倍。通過(guò)PCR實(shí)驗(yàn)篩選得到SNAT純合突變體SALK_032239。選取AtSNAT的突變體和過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行表型觀察,Col-0的根長(zhǎng)為4.6±0.16cm,snat的根長(zhǎng)為3.47±0.25cm,SNAT1-OE與SNAT3-OE根長(zhǎng)分別為5.2±0.17cm、5.3±0.13cm,這一結(jié)果表明,SNAT基因缺失導(dǎo)致根的生長(zhǎng)受阻;SNAT基因過(guò)表達(dá)促進(jìn)根的生長(zhǎng)。在313nm UV-B輻射下,不同時(shí)間段分別處理SNAT的不同剪切本過(guò)表達(dá)株系SNAT1-OE、SNAT3-OE、Col-0和snat擬南芥。qRT-PCR結(jié)果表明,UV-B處理2h時(shí),褪黑素合成酶基因SNAT、COMT、ASMT的mRNA相對(duì)表達(dá)量峰值遠(yuǎn)大于Col-0或者snat;ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),UV-B處理4h時(shí),SNAT1、SNAT3過(guò)表達(dá)植株褪黑素含量分別是Col-0增幅的1倍和2倍,是snat突變體的3倍和3.2倍。同時(shí),在褪黑素合成酶SNAT、COMT和ASMT基因和褪黑素含量方面,SNAT3-OE植株的表達(dá)都比SNAT1-OE顯著。(3)我們通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了UV-B信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)情況,結(jié)果表明,與Col-0植株相比,SNAT過(guò)表達(dá)植株中HY5(ELONGATED HYPOCOTYL 5)的相對(duì)表達(dá)量明顯上升,同時(shí)COP1(CONSTITUTIVELYPHOTOMORPHOGENIC 1)、HYH(HY5HOMOLOG)、RUP1(REPRESSOR OF UV-B PHOTOMORPHOGENESIS 1)和RUP2(REPRESSOR OF UV-B PHOTOMORPHOGENESIS 2)的相對(duì)表達(dá)量也明顯上升;snat突變體植株中HY5的相對(duì)表達(dá)量最小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,SNAT基因可以影響UV-B信號(hào)通路,同時(shí)其下游效應(yīng)基因APX(Ascorbate Peroxidase)、SAPX(Chloroplast APX)、CAT1(Catalase1)、CSD1(Cytosolic Superoxide Dismutase 1)的相對(duì)表達(dá)量提高,引發(fā)植物機(jī)體內(nèi)ROS含量降低。DAB染色、NBT染色、H_2O_2含量測(cè)定結(jié)果表明在4h、6h時(shí),過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)ROS含量少于Col-0和snat;MDA含量測(cè)定結(jié)果表明在4h、6h時(shí),過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)MDA含量低于Col-0和snat;電解質(zhì)泄露實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在2h、4h、6h,過(guò)表轉(zhuǎn)基因植株的電導(dǎo)率值小于Col-0和snat。這些結(jié)果說(shuō)明擬南芥體內(nèi)褪黑素含量的增加提高了植株對(duì)于UV-B輻射的感知,并提高了抗性,同時(shí)SNAT的剪切本SNAT3-OE株系對(duì)于UV-B的抗性強(qiáng)于SNAT1-OE。
【圖文】：

第一章 緒論葉綠體，可能會(huì)以不同的模式影響褪黑素在植物中胺在衰老的水稻葉片中高含量積累，而色胺和 N-中通過(guò) T5H 可快速將色胺轉(zhuǎn)化為 5-羥色胺，但 5-羥轉(zhuǎn)化緩慢，，所以 SNAT 也是合成途徑的限速酶。存成途徑在維持褪黑素穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，同時(shí)植誘導(dǎo)褪黑素的合成[37,38]。

圖 1-2 植物褪黑素合成的多種途徑[36]Fig.1-2 The multiple pathways of melatonin biosynthesis in plants[36].TDC，色氨酸脫羧酶；TPH，色氨酸羥化酶；T5H，色胺 5-羥化酶；SNAT，5-羥色胺SMT，乙酰 5-羥色胺甲基轉(zhuǎn)移酶；COMT，咖啡酸甲基轉(zhuǎn)移酶；ER，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。 1-3 擬南芥 SNAT 、COMT and ASMT 參與的褪黑素生物合成的概述[39]3 Overview of possible melatonin biosynthesis by SNAT 、COMT and ASMT in ArabidASMT/ASMT/ASMT
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q943.2

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