【摘要】：蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase,PDI)可以催化二硫鍵異構(gòu)化、氧化及還原,也往往具有分子伴侶功能。來源于不同動、植物的PDI的活性中心都有2對保守半胱氨酸(Cys),突變后造成催化活性喪失,但不影響PDI的分子伴侶功能。前期研究表明體外重組表達(dá)的擬南芥AtPDI1具有二硫鍵異構(gòu)酶活性,且能提高大腸桿菌細(xì)胞的抗逆能力。為了探究AtPDI1在植物體內(nèi)是否有抗逆功能且是否與其二硫鍵異構(gòu)酶活性有關(guān),本研究將編碼AtPDI1活性位點(diǎn)的Cys序列進(jìn)行了突變,并回補(bǔ)擬南芥AtPDI1缺失突變體(pdi),研究不同株系對非生物脅迫的響應(yīng),主要研究結(jié)果如下:(1)突變AtPDI1活性中心半胱氨酸位點(diǎn)的編碼序列,構(gòu)建表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥pdi,獲得T3代純合轉(zhuǎn)基因植株。將編碼AtPDI1活性位點(diǎn)的Cys(Cys128/Cys131、Cys467/Cys470)的密碼子進(jìn)行突變,得到兩個(gè)突變體AtPDI1,即PDI1_(C128AC131A)和PDI1_(C467AC470A),用PDI1_(m1)和PDI1_(m2)表示。將之前構(gòu)建的野生型AtPDI1及PDI1_(m1)和PDI1_(m2)轉(zhuǎn)化擬南芥pdi,通過抗生素篩選、外源基因PCR鑒定,在T_3代獲得純合的轉(zhuǎn)基因株系,分別表示為pdi-PDI1_(m1)、pdi-PDI1_(m2)和pdi-PDI1。(2)AtPDI1活性半胱氨酸位點(diǎn)突變影響了種子萌發(fā)階段對脅迫的耐受性。對上述3個(gè)株系及野生型擬南芥(WT)、AtPDI1超表達(dá)株系(WT-PDI1)及pdi進(jìn)行不同的處理,在非脅迫培養(yǎng)下,不同株系的萌發(fā)率及萌發(fā)速度基本一致,但脅迫培養(yǎng)下(培養(yǎng)基分別含有NaCl、甘露醇、H_2O_2和ABA),各株系的萌發(fā)差異明顯,pdi-PDI1_(m1)和pdi-PDI1_(m2)的萌發(fā)率明顯低于pdi-PDI1,pdi-PDI1的萌發(fā)率與WT相似,但低于超表達(dá)株系WT-PDI1;脅迫條件下根長的差異與萌發(fā)率有相似的趨勢。(3)AtPDI1活性半胱氨酸位點(diǎn)突變也影響了幼苗對脅迫的耐受性。對苗期的不同AtPDI1株系進(jìn)行脅迫處理,結(jié)果表明鹽脅迫、滲透脅迫、低溫和高溫處理后,pdi-PDI1_(m1)、pdi-PDI1_(m2)和pdi突變體均表現(xiàn)出較低的脅迫耐受性,與WT、pdi-PDI1和WT-PDI1相比,生長緩慢,存活率較低;WT-PDI1抗性最強(qiáng),pdi-PDI1與WT較為接近,說明野生型PDI1可以回補(bǔ)pdi功能的缺失,而保守半胱氨酸突變之后則不能回補(bǔ)pdi功能的缺失,表型與pdi相似,抗逆能力降低。(4)AtPDI1抗逆功能與ABA信號途徑有關(guān)。利用qRT-PCR技術(shù)對ABA合成有關(guān)的基因(NCED3、ABA1、ABA2)的表達(dá)量進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下pdi-PDI1_(m1)、pdi-PDI1_(m2)與pdi突變體的上調(diào)倍數(shù)差異不大,但明顯低于pdi-PDI1、WT和WT-PDI1;鹽脅迫也影響了ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因(RD29A、KIN1、AnnAt)的表達(dá),不同株系變化趨勢的差異與ABA合成有關(guān)的基因類似。說明AtPDI1提高植物的抗逆能力與ABA合成和其信號途徑有關(guān),且保守Cys對AtPDI1功能的發(fā)揮起重要作用。(5)AtPDI1活性位點(diǎn)突變影響了植物體內(nèi)ROS清除能力。對鹽和滲透脅迫處理后的ROS積累量進(jìn)行了NBT染色檢測,pdi-PDI1_(m1)、pdi-PDI1_(m2)與pdi的染色程度最深,說明其ROS積累多;pdi-PDI1與WT的染色次之,但重于WT-PDI1的染色。各株系活性氧清除相關(guān)基因SOD、POD、CAT和APX的表達(dá)與ROS的積累相反,WT-PDI1表達(dá)量上調(diào)倍數(shù)最多,而pdi-PDI1_(m1)、pdi-PDI1_(m2)與pdi的上調(diào)倍數(shù)最低。以上研究結(jié)果表明,AtPDI1催化二硫鍵的功能對其在植物中發(fā)揮抗非生物脅迫的功能直接相關(guān),且AtPDI1的抗逆功能與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及活性氧清除有關(guān)。
【圖文】：

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文圖 1-1 蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)圖Fig. 1-1 Domain organization of PDI酵母 PDI 的分子結(jié)構(gòu)研究較為深入，其全長 PDI 的晶體結(jié)構(gòu)已被解）。酵母 PDI 由 a、b、b’、a’結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)鏈接子（x）和一個(gè)羧以 a、b、b’、x、a’、c 的順序排列構(gòu)成（如圖 1-2 所示）。酵母 P，U型的兩個(gè)活動側(cè)臂分別由 a結(jié)構(gòu)域和 a’結(jié)構(gòu)域組成，而 b 結(jié)構(gòu)對固定的 U 型結(jié)構(gòu)的底部，U 型結(jié)構(gòu)的疏水內(nèi)表面為 PDI 結(jié)合底 PDI 的空間示意圖如圖 1-2 所示。

之間的兩個(gè)氨基酸在氧化還原電位中也起著至關(guān)重要的作用（Ellgaard and Ruddock,2005；Martin, 1995）。硫氧還蛋白超家族成員還包括 DsbA（一種細(xì)菌氧化酶）、DsbC（一種大腸桿菌的周質(zhì)蛋白）、硫氧還蛋白、谷氧還蛋白和維生素 K 環(huán)氧化物還原酶（VKOR）等。具有硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域的氧化還原蛋白可以作為是二硫鍵的還原劑，如硫氧還蛋白本身；也可以是二硫醇的氧化劑，如 DsbA 和 PDI；或者是轉(zhuǎn)移非天然二硫鍵的異構(gòu)酶，如 PDI 和 DsbC（Messens and Collet, 2006；Wilkinson and Gilbert, 2004）。含有硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)具有氧化還原活性，其催化機(jī)制與巰基/二硫鍵的轉(zhuǎn)換有關(guān)（如圖 1-3）。硫氧還蛋白超家族活性位點(diǎn)中的半胱氨酸可以作為二硫鍵（氧化）狀態(tài)的電子受體或巰基（還原）狀態(tài)的電子供體。在電子轉(zhuǎn)移到底物分子或從底物分子轉(zhuǎn)移電子期間，，CXXC 催化基序可逆地從一種氧化還原狀態(tài)轉(zhuǎn)換到另一種氧化還原狀態(tài)（Gruber et al., 2006）。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2637214