【摘要】：苯丙氨酸氨基變位酶(Phenylalanine aminomutase,PAM)是MIO(4-亞甲基-咪哇-5-酮)家族酶中的一種。MIO是由高度保守的三聯(lián)體氨基酸(Ala-Gly-Ser)在蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中經(jīng)過(guò)兩次脫水形成的具有較強(qiáng)親電性的基團(tuán),是一種不同于PLA、NADH等外源性輔因子的新型酶輔因子。MIO能夠親電進(jìn)攻底物α-苯丙氨酸的氨基,導(dǎo)致底物的氨基從α-位變位至β-位,形成產(chǎn)物β-苯丙氨酸。因而PAM可以用來(lái)合成高附加價(jià)值的β-苯丙氨酸。為建立酶法生產(chǎn)β-苯丙氨酸的工藝,首先克隆來(lái)源于成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)的苯丙氨酸氨基變位酶基因,構(gòu)建PaPAM重組菌實(shí)現(xiàn)其在大腸桿菌中的高效表達(dá)并純化制備高純度的重組酶,對(duì)其發(fā)酵、誘導(dǎo)表達(dá)條件及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究;在此基礎(chǔ)上,利用同位素標(biāo)記的方法采用核磁(NMR)、質(zhì)譜(MS)解析PaPAM催化反應(yīng)分子機(jī)制。本文優(yōu)化了酶誘導(dǎo)表達(dá)以及催化反應(yīng)的最佳條件并對(duì)其催化反應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了初步解析為進(jìn)一步設(shè)計(jì)合成β-苯丙氨酸奠定基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容如下:(1)克隆來(lái)源于Pantoea agglomerans的苯丙氨酸氨基變位酶基因(pam),構(gòu)建重組苯丙氨酸氨基變位酶的大腸桿菌表達(dá)載體pET28a-pam轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中表達(dá),采用親和層析制備電泳純的重組酶(PaPAM)并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征。結(jié)果表明,成功克隆得到基因pam,長(zhǎng)度為1626 bp,編碼541個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的PaPAM,構(gòu)建了大腸桿菌表達(dá)載體pET28a-pam,轉(zhuǎn)入E.coli BL21中經(jīng)IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)表達(dá),鎳柱親和層析純化獲得電泳純的重組PaPAM。該酶在最適反應(yīng)條件下(30℃、pH9、1.5 mol/L NH4+),活力達(dá)到2.5 U/mg,在30～50℃、pH 8～10下PaPAM具有較高的穩(wěn)定性,金屬離子Na+、Mg2+、Ca2+、Fe3+對(duì)PaPAM活性影響較小;Mn2+、Zn2+、Cu2+抑制PaPAM的活性,表面活性劑SDS和Triton 100對(duì)PaPAM活性較強(qiáng)抑制作用。MS和NMR結(jié)果表明,重組PaPAM能異構(gòu)化α-苯丙氨酸生成β-苯丙氨酸。(2)利用同位素標(biāo)記的方法采用MS和NMR解析PaPAM催化反應(yīng)分子機(jī)制。結(jié)果表明:將未帶標(biāo)記的底物α-苯丙氨酸于重水溶液中反應(yīng)所生成產(chǎn)物分子量無(wú)變化證明該酶催化反應(yīng)未從外界溶液中吸收氫質(zhì)子;將15N標(biāo)記以及3,3-D標(biāo)記α-苯丙氨酸于水溶液中反應(yīng),依據(jù)反應(yīng)過(guò)程中氫質(zhì)子位置的變化,證明酶催化反應(yīng)過(guò)程中α位氨基與pro-3R位氫質(zhì)子發(fā)生分子內(nèi)交換。PaPAM將底物的α-NH2傳遞至β位取代pro-3R氫質(zhì)子的同時(shí)pro-3R氫轉(zhuǎn)移到a位生成產(chǎn)物β-苯丙氨酸。(3)對(duì)該重組菌發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)基成分及誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化。結(jié)果表明,該酶發(fā)酵過(guò)程中最佳碳源、氮源分別為甘油和胰蛋白胨且最適添加濃度均為1.5%;培養(yǎng)基中添加Mg2+、Ca2+、+對(duì)該重組菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶影響較小,添加Zn2+則有抑制作用;誘導(dǎo)劑IPTG最佳加入時(shí)間為當(dāng)菌體濃度OD668=0.6,添加終濃度為0.4 mmol/L,誘導(dǎo)表達(dá)最適溫度為26℃,最佳誘導(dǎo)表達(dá)誘導(dǎo)時(shí)間為14h。
【圖文】：

它們的衍生物立體選擇性合成Ｐ－苯丙氨酸［１３］；邋Ｃｕｒｔｉｕｓ重排［１４］，例如通過(guò)中間體逡逑共軛加成ａ，Ｐ－不飽和酯和酰亞胺［１５］合成；以及通過(guò)不對(duì)稱內(nèi)酰胺合成或逡逑利用外消旋混合物中拆分對(duì)映體來(lái)進(jìn)行合成ｔ１７Ｕ具體合成路線如下圖１－１所示）。逡逑但由于對(duì)映體拆分合成Ｐ－氨基酸條件苛刻存在困難且化學(xué)合成方法存在生產(chǎn)工逡逑藝復(fù)雜、環(huán)境污染嚴(yán)重、生成多種副產(chǎn)物等缺陷，因此需要發(fā)展綠色、新穎、生逡逑產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單的生物方法合成Ｐ？氨基酸。逡逑１逡逑

圖１－２邋ＳＡＭ依賴型氨基變位酶催化反應(yīng)機(jī)制逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ｏｆ邋ＳＡＭ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ａｍｉｎｏｍｕｔａｓｅ逡逑ＳＡＭ依賴型氨基變位酶的作用機(jī)制［３Ｓ］（圖１－２）與腺苷鈷胺素依賴型氨基變逡逑位酶的作用機(jī)制類(lèi)似，在催化過(guò)程中都需先形成５＇－脫氧腺苷自由基（Ａｄｏ）邋［３９，４°］。逡逑早在１９８７年Ｍｏｓｓ，Ｍ．等人就已通過(guò)同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)證明了邋Ａｄｏ在賴氨酸２，３－氨逡逑基變位酶中的作用［３８１然而Ａｄｏ的準(zhǔn)確來(lái)源仍然不清楚，因?yàn)椋樱佘占琢虬彼徨义希ǎ樱粒停┲械模茫渔I鍵能很高并不太可能發(fā)生均裂［４１］。最終認(rèn)為［４Ｆｅ－４Ｓ］簇是將逡逑ＳＡＭ轉(zhuǎn)化成甲硫氨酸和Ａｄｏ自由基的電子供體。越來(lái)越多的證據(jù)表明，，生物學(xué)逡逑中鐵硫簇的協(xié)調(diào)性很強(qiáng)。在好幾個(gè)有可能的電子轉(zhuǎn)移機(jī)制中［４２］，都因?yàn)榱螂x子和逡逑４逡逑
【學(xué)位授予單位】：安徽工程大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q78;Q55

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本文編號(hào)：2629600