【摘要】：端粒長度的動態(tài)平衡決定著細胞增殖潛能,對于相應(yīng)的細胞功能至關(guān)重要。端粒長度縮短過程主要有細胞分裂過程中端粒縮短和端粒修剪(Telomere trimming)快速調(diào)控。端粒長度延長過程則是通過激活端粒酶活性或端粒延伸替代機制(ALT)延長反應(yīng)。端�？s短和端粒延長之間動態(tài)平衡決定干細胞和生殖細胞的端粒長度,表明端粒長度應(yīng)當(dāng)受到嚴格控制,而此過程中相關(guān)端粒結(jié)合蛋白起到重要作用。目前已知直接結(jié)合端粒重復(fù)序列蛋白質(zhì)組包括shelterin復(fù)合物的三個成員(TRF1,TRF2和POT1結(jié)合單鏈DNA)和HOT1蛋白質(zhì)。而本文主要分三部分闡述若干鋅指蛋白質(zhì)識別(亞)端粒DNA的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究。論文第一部分為人源TZAP蛋白質(zhì)(ZBTB48,更名為端粒相關(guān)鋅指蛋白質(zhì))與端粒DNA TTAGGG結(jié)構(gòu)與功能的研究。TZAP蛋白質(zhì)可直接結(jié)合到端粒雙鏈DNA TTAGGG序列并誘發(fā)端粒修剪過程,參與端粒長度調(diào)控。TZAP蛋白質(zhì)由N-端BTB/POZ結(jié)構(gòu)域和C-端的11個串聯(lián)C2H2鋅指(Znf1-11)組成。研究發(fā)現(xiàn)TZAP對端粒DNA TTAGGG結(jié)合能力定位于第9-11個鋅指Znf9-11,并且進一步研究表示結(jié)合能力主要由ZnF1 1貢獻。雖然C2H2鋅指結(jié)合DNA的特異性和機制已被深入研究,但TZAP是第一個直接結(jié)合端粒DNA的C2H2鋅指蛋白質(zhì)。端粒結(jié)合蛋白TRF1,TRF2和HOT1以homeodomains結(jié)構(gòu)域識別雙鏈端粒DNA,且不識別亞端粒DNA,而TZAP蛋白質(zhì)偏好性地識別不同類型亞端粒DNA。因此,TZAP特異性識別(亞)端粒DNA的機制仍需進一步研究。TZAP_ZnF9-11-C蛋白質(zhì)與18bp TTAGGG雙鏈核苷酸復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)證明第11個鋅指Znf1 1負責(zé)識別G4G5G6三聯(lián)體,C末端保守氨基酸負責(zé)識別T2A3,該復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)為TZAP識別端粒DNA提供分子基礎(chǔ)。論文第二部分為ZBTB10、Znf827、TR4/COUP-TF2 C4等鋅指蛋白質(zhì)與(亞)端粒序列結(jié)構(gòu)與功能的研究。Dennis Kappei課題組篩選得到TZAP蛋白質(zhì)時,獲得另一個端粒DNA結(jié)合蛋白質(zhì)ZBTB10。ZBTB10與TZAP(ZBTB48)皆屬于Kruppel-like C2H2鋅指蛋白質(zhì)家族,其含有N端BTB/POZ結(jié)構(gòu)域和C端兩個串聯(lián)C2H2(Znf1-2)鋅指結(jié)構(gòu)域。分析ZBTB10核酸序列,發(fā)現(xiàn)在兩個串聯(lián)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域后還存在一個保守C2HR類鋅指結(jié)構(gòu)域。通過熒光偏振實驗發(fā)現(xiàn)C2HR類鋅指對于ZBTB10蛋白質(zhì)識別端粒序列至關(guān)重要。因此,旨在解析ZBTB10蛋白質(zhì)與端粒DNA高分辨率復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu),為闡述ZBTB10蛋白質(zhì)識別端粒DNA的特異性提供分子基礎(chǔ)。目前已獲得初篩晶體,仍需進一步重復(fù)和優(yōu)化晶體。澳大利亞悉尼大學(xué)HildaAPickett研究組發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白質(zhì)Znf827能夠募集NuRD(Nucleosome Remodeling and histone Deacetylase complex)復(fù)合物至ALT端粒區(qū)域,促進ALT機制發(fā)生。課題組孫愛愛博士闡述Znf827如何募集NuRD復(fù)合物,但Znf827-NuRD復(fù)合物如何定位到ALT端粒區(qū)域仍有待研究。Hilda A Pickett在文章中提出TR4和COUP-TF2兩個孤兒核受體(orphan nuclear receptor)蛋白質(zhì)可能在募集Znf827-NuRD中起重要作用。另一方面,關(guān)注到Znf827蛋白質(zhì)自身包含9個C2H2(Znf1-9)鋅指,可能也具有ALT端粒DNA結(jié)合能力。此課題期望通過解析TR4/COUP-TF2 C4鋅指、Znf827與(亞)端粒DNA復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu),闡述其定位于ALT端粒區(qū)域的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。目前已獲得初篩晶體,仍需進一步重復(fù)和優(yōu)化晶體。論文第三部分初步探索AEBP2鋅指蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能。多梳抑制家族復(fù)合物PRC2的游離組分AEBP2與核心組分RBBP4和SUZ12相互作用,從而進一步增加PRC2核心復(fù)合物穩(wěn)定性,同時也一定程度地提高PRC2多元復(fù)合物酶活性。AEBP2串聯(lián)三個C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域C端存在一段富含精氨酸和賴氨酸區(qū)域(RRK區(qū)域),與TZAP蛋白質(zhì)C端保守序列相似,由此猜測AEBP2 RRK區(qū)域可能對于AEBP2蛋白質(zhì)識別dsDNA有重要作用。本課題期望解析AEBP2鋅指蛋白質(zhì)與DNA復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu),并且闡述其分子機制。目前已通過熒光偏振實驗證明RRK區(qū)域?qū)τ贏EBP2蛋白質(zhì)結(jié)合T1 DNA序列尤為重要,仍需進一步獲得復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。
【圖文】：

核生物線性染色體末端，由眾多重復(fù)核酸序列以及相的蛋白質(zhì)－ＤＮＡ復(fù)合結(jié)構(gòu)。端粒保護使線性染色體機制識別為ＤＮＡ損傷從而避免部分損傷修復(fù)機制破性。大多數(shù)原核生物具有圓形染色體而非線性染色體，分細菌（例如鏈霉菌，農(nóng)桿菌和疏螺旋體中）染色體它們在結(jié)構(gòu)和功能上與真核生物線性染色體末端端構(gòu)呈現(xiàn)出兩種形式：與線性染色體末端的端粒結(jié)合蛋體末端自身形成單鏈ＤＮＡ發(fā)夾環(huán)。在哺乳動物細胞ＤＮＡ由大約１０００－２５００個重復(fù)ＤＮＡ序列ＴＴＡＧＧＧ重復(fù)核酸序列ＡＡＴＣＣＣ。端粒ＤＮＡ大部分區(qū)域為雙為Ｇ鏈，另一條與之互補且富含Ｃ／Ａ鏈稱為Ｃ鏈。Ｇ式結(jié)尾，形成３’－ｏｖｅｒｈａｎｇ。３’－ｏｖｅｒｈａｎｇ可以侵入到配對，形成Ｔ－ｌｏｏｐ結(jié)構(gòu)⑴（圖丨．丨）。研宄表明，端Ｔ序列的Ｇ鏈能夠形成分子內(nèi)或分子間鳥嘌呤四聯(lián)體級結(jié)構(gòu)較線性染色體更加穩(wěn)定。邐逡逑

端粒ＤＮＡ重復(fù)序列在不同種屬中具有偏好性，哺乳動物的端粒重復(fù)核酸序逡逑列一般是ＴＴＡＧＧＧ［３］，且ＤＮＡ重復(fù)序列的長度會有些許差異，如人類端粒重復(fù)逡逑核酸片段大約１０－１５邋ｋｂ，而小鼠端粒重復(fù)核酸片段大約２０－５０邋ｋｂ。如圖１．２所示，逡逑即為不同細胞系中端粒重復(fù)核酸序列組成［４］。由此可見，除了典型端粒重復(fù)核酸逡逑序列ＴＴＡＧＧＧ以外，還存在著許多亞端粒類型，常見的為ＴＣＡＧＧＧ，ＴＴＧＧＧＧ，逡逑ＴＴＣＧＧＧ等。逡逑ＷＩ３８－ＶＡ１３／２ＲＡ邐ＨｅＬａ逡逑（ＡＬＴ）邐（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ）逡逑敘邐：：：啊逡逑ｅ－ＣＴ？ＣＧＧ逡逑２．７％邐■邋■邋ＴＧＡＧＧＧ逡逑？ＴＴＧＧＧＧ逡逑Ｓ＞ＴＡＡＧＧＧ逡逑：：＝逡逑圖１．２不同細胞系中端粒重復(fù)核酸序列的組成成分Ｗ逡逑端粒與線性染色體體內(nèi)定位、末端保護、復(fù)制分裂密切相關(guān)，影響細胞的分逡逑裂、生長、凋亡、衰老、分化和永生化［５，６】等生命過程。不同類型細胞的增殖次逡逑數(shù)有所差別，干細胞、生殖細胞以及腫瘤細胞能夠無限增殖，而體細胞的端粒長逡逑度會隨著ＤＮＡ復(fù)制而縮短，當(dāng)細胞分裂增殖的次數(shù)達到上限時，端粒的長度縮逡逑短到極限，遺傳信息大量丟失，，無法維持細胞正常的生命周期，細胞將停止復(fù)制逡逑增殖走向衰老或死亡［７＿９］。細胞衰老與許多癌癥密切相關(guān)
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q75

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本文編號：2629111