發(fā)布時(shí)間：2020-04-10 15:15

【摘要】：人類與非人類靈長類動(dòng)物之間大腦的不同之處在很大程度上是未知的,尤其是大腦功能差異,包括人類特有的社會(huì)和認(rèn)知行為以及一些精神障礙。但是,導(dǎo)致這些差異背后的基因組水平上復(fù)雜驅(qū)動(dòng)因素仍不清楚。通過與非人類靈長類動(dòng)物基因序列比較,揭示基因水平的差異與表型變異之間的聯(lián)系,是大腦進(jìn)化遺傳學(xué)研究的主要目標(biāo)。已有假設(shè)認(rèn)為大量非編碼區(qū)域的調(diào)控元件的變異是導(dǎo)致人類與其親緣關(guān)系較近的其他靈長類之間表型的差異的關(guān)鍵因素之一。因此,對(duì)潛在的大腦相關(guān)基因調(diào)控區(qū)進(jìn)行進(jìn)化及其功能分析,有助于更好理解人類大腦在適應(yīng)性進(jìn)化中分子水平上的差異如何導(dǎo)致表型性狀的差異,也是本課題的主要研究目的�；蚪M中的DNaseⅠ超敏感位點(diǎn)(DNase Ⅰ hypersensitive site,DHS)偶聯(lián)多種活性調(diào)控元件,包括啟動(dòng)子,增強(qiáng)子,沉默子,絕緣子與基因座位控制區(qū)。目前成熟的DHS-seq技術(shù)實(shí)現(xiàn)了高通量的DHS數(shù)據(jù)產(chǎn)出,不斷完善DHS圖譜。其中ENCODE計(jì)劃與人類表觀基因組計(jì)劃中已發(fā)布數(shù)百個(gè)不同細(xì)胞系,不同組織的DHS數(shù)據(jù),被廣泛地應(yīng)用在調(diào)控區(qū)域的研究中。近年來,多項(xiàng)靈長類之間DHS進(jìn)化研究證明了這些區(qū)域在基因調(diào)控中具有重要作用,并因此影響人類特有的性狀。此外,本課題組在先前研究中結(jié)合DHS對(duì)免疫系統(tǒng)中的主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)及抗病毒家族——TRIM(Tripartite motif)家族成員的調(diào)控區(qū)域進(jìn)行靈長類之間進(jìn)化分析與功能分析,進(jìn)一步證實(shí)了DHSs在靈長類動(dòng)物適應(yīng)性進(jìn)化中的作用。在本研究中,我們利用生物信息學(xué)方法,結(jié)合DHS數(shù)據(jù)對(duì)靈長類大腦相關(guān)基因調(diào)控區(qū)域中的加速進(jìn)化調(diào)控元件進(jìn)行功能性分析,推測這些加速進(jìn)化的DHSs在靈長類大腦進(jìn)化過程中的作用與意義。并結(jié)合CRISPR/Cas9敲除技術(shù),Western Blotting技術(shù)與qPCR(real-time quantitative PCR,實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增)技術(shù)對(duì)加速進(jìn)化DHS進(jìn)行功能性驗(yàn)證。其結(jié)果如下:(1)在本研究中,根據(jù)本課題組先前研究中分析鑒定得到的2397個(gè)大腦相關(guān)加速進(jìn)化DHSs(brain related accelerated DHSs,brain-aceDHSs),通過基因組注釋文件與基因組調(diào)控區(qū)注釋數(shù)據(jù),揭示了brain-aceDHSs在基因組上的分布特征:大部分brainaceDHSs富集在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上下游10kb內(nèi),并主要分布在內(nèi)含子與基因間區(qū)中,僅有少數(shù)一部分定位在基因編碼區(qū)與啟動(dòng)子中。其中75個(gè)brain aceDHS與啟動(dòng)子區(qū)域重疊,303個(gè)與增強(qiáng)子重疊,1121個(gè)與具有轉(zhuǎn)錄元件特征的區(qū)域重疊。(2)根據(jù)UCSC已發(fā)布的Hi-C數(shù)據(jù)庫,鑒定出潛在受brain-aceDHSs調(diào)控的544個(gè)靶基因富集在細(xì)胞增殖與周期的通路上,與大腦與神經(jīng)發(fā)育密切相關(guān)。除此之外,發(fā)現(xiàn)部分brain-aceDHSs靶基因與報(bào)道的唐氏綜合癥或大腦疾病的相關(guān)基因一致。重要的是,本研究根據(jù)已有的人類,黑猩猩與恒河猴大腦組織表達(dá)數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)部分靶基因(部分靶基因在數(shù)據(jù)集中不具有表達(dá)數(shù)據(jù))在人類與非人靈長類間呈現(xiàn)出表達(dá)模式的差異。(3)通過多序列比對(duì)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫比對(duì),表明brain-aceDHS中有61個(gè)潛在的人特異性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),包括CTCF,FOXH1和FOXQ1。此外,基于GWAS SNP,Hi-C和大腦組織的eQTL SNP數(shù)據(jù),定位到16個(gè)GWAS SNPs和82個(gè)eQTL SNPs位于brain-aceDHS中,其調(diào)控與大腦發(fā)育或其他人類疾病相關(guān)的基因。(4)為了證實(shí)這些brain-aceDHSs中調(diào)控元件的功能,本研究使用CRISPR/Cas9敲除技術(shù),并結(jié)合western blotting技術(shù)與qPCR技術(shù)證實(shí)了敲除brain-aceDHS(chr12:131621602-131623539)后,其靶基因GPR133的表達(dá)顯著下降,表明了這個(gè)brain-aceDHS的增強(qiáng)子功能。有研究表明GPR133基因與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤相關(guān),故本研究進(jìn)一步證明了brain-aceDHSs內(nèi)的SNP與大腦疾病的關(guān)聯(lián)。綜上所述,本研究從大腦相關(guān)基因調(diào)控區(qū)的變異分析,對(duì)于更好地理解在適應(yīng)性進(jìn)化中人類大腦表型差異形成的遺傳學(xué)基礎(chǔ)提供了重要線索。
【圖文】：

華南理工大學(xué)碩士學(xué)位論文分布在內(nèi)含子與基因間區(qū)（圖 3-2）。與所有用于進(jìn)化分析的大腦相關(guān) DHS 相比，內(nèi)含子的比例在 brain-aceDHSs 中顯著提高（51.23％與 54.90％，P = 0.05）; 基因間區(qū)的比例極顯著下降（40.96％與 38.13％，p <2.2e-16）； 同時(shí)外顯子的比例也是極顯著下降（1.87％與 0.92％，p=0.0008）。p 值使用皮爾遜的卡方檢驗(yàn)進(jìn)行計(jì)算。與總的大腦相關(guān)DHS 相比，brain-aceDHS 在非編碼區(qū)顯著富集，與非編碼區(qū)比編碼區(qū)更容易進(jìn)化和獲得新功能的結(jié)果一致。值得注意的是， brain-aceDHSs 中的內(nèi)含子比例顯著高于大腦相關(guān)DHSs，，而已有文獻(xiàn)報(bào)道內(nèi)含子能夠通過多種途徑影響基因的表達(dá)[4]。

每個(gè)brain-aceDHS與最近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）的距離
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：2622383