【摘要】：內(nèi)切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶作為糖苷酶家族的一員,它的主要作用方式是水解糖蛋白糖鏈上兩個(gè)N-乙酰葡糖胺之間的β-1,4糖苷鍵。內(nèi)切β-N-乙酰氨基葡糖苷酶分別屬于GH18家族和GH85家族。由于內(nèi)切β-N-乙酰氨基葡糖苷酶的去糖基化作用,因此在糖組學(xué)和糖生物學(xué)的研究中被廣泛的使用。本文在苜蓿鏈霉菌ACCC40021全基因組測序的基礎(chǔ)上,通過生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)了一種新的內(nèi)切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因,CAZy表明該酶屬于GH18家族一員,通過與文獻(xiàn)中已報(bào)道β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶氨基酸序列進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn),與GH18家族的EndoFV和EndoT序列的相似性分別為38.19%和38.21%。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的其他內(nèi)切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和其他幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行同源比較,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,根據(jù)結(jié)果可知,該酶與球孢子菌屬幾丁質(zhì)酶III型親緣關(guān)系最近。根據(jù)目的基因序列,構(gòu)建了以pET30a(+)為載體的重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中,成功誘導(dǎo)表達(dá)出目的蛋白,通過鎳柱純化后,獲得純的目的蛋白。以RNaseB作為反應(yīng)底物,我們研究了該酶的酶學(xué)性質(zhì)。該酶比活力為1.0×10~6U/mg,最適反應(yīng)溫度為35℃,在溫度30℃-45℃范圍內(nèi),有較好的熱穩(wěn)定性;最適反應(yīng)pH為6,在pH值4-8之間,該酶保持有較高的酶活。選用酵母表達(dá)的糖基化糖化酶、果膠酶、酸性蛋白酶為底物,確定了能夠完全的去糖基化,為糖蛋白糖基化位點(diǎn)研究提供了一種新的工具酶。應(yīng)用該酶處理奶酪等奶制品加工的副產(chǎn)物乳清蛋白,從中制備寡糖鏈。在最適條件下,當(dāng)加酶量為1 mg時(shí),每分鐘從每毫升乳清中可獲得寡糖鏈0.95 mg。
【圖文】：

圖 2 酶法合成 CD52 蛋白糖鏈[41]Fig.2 The Enzymatic synthesis of CD52 protein sugar chain[41]（3）糖蛋白的改造牛胰核酸酶 B 是利用內(nèi)切 β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶進(jìn)行 N-糖鏈修飾的一種的蛋白受體，在實(shí)驗(yàn)中常用商品化的 EndoH 處理牛胰腺核酸酶 B，牛胰腺核酸是由 124 個(gè)氨基酸組成，在它第 34 位的天冬酰胺氨基酸殘基上連接有一個(gè)糖基點(diǎn)，通過這個(gè)位點(diǎn)連接一個(gè)高甘露糖型的糖鏈，EndoH 通過水解作用切除寡糖連一個(gè)去糖基化的牛胰腺核酸 B，然后以其為底物通過內(nèi)切 β-N-乙酰氨基葡糖苷酶糖基作用，獲得一個(gè)新的寡糖鏈，從而構(gòu)成新的糖蛋白。在 2006 年 wang 等研員首次證明了使用嗯唑啉作為寡糖鏈的供體比使用天然糖鏈作為供體而后通過基作用得新合成的牛胰腺核酸酶 B 的產(chǎn)率更高，從而為糖蛋白的合成提供了一的思路。如圖 3（a）所示。隨后其用不同的嗯唑啉作為糖鏈的供體合成了帶有類型的牛胰腺核酸酶 B，這些新合成的牛胰腺核酸酶 B 還可以作為底物進(jìn)一步進(jìn)學(xué)修飾[49]。在 2009 年 wang 通過對原有野生型的 EndoA 和 EndoM 的基因序列進(jìn)變獲取突變體 EndoA-N1717A 和 EndoM-N175A，單獨(dú)使用突變體 EndoA-N1717行轉(zhuǎn)糖基作用得到了較高產(chǎn)率的改造型牛胰腺核酸酶 B，如圖 3（b）所示。并

程中起到保護(hù)葡萄糖殘基的作用，，防止葡萄糖殘基被內(nèi)切酶水解，最后連接葡萄糖的末端甘露糖被甘露糖苷酶水解去除。這一方法為以后糖蛋白的定向改造提供了珍貴的借鑒意義，如圖 3（d）所示。在 2016 年來自德國 Fairbanks 等研究人員首先使 N-末端甘露糖殘基磷酸化，然后通過內(nèi)切 β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的作用合成了含有磷酸基團(tuán)的糖蛋白，這里的磷酸基團(tuán)起到一個(gè)標(biāo)識(shí)的作用，通過特異性磷酸受體的識(shí)別，可用于溶酶體貯積癥的治療過程[51]。合成過程如圖 3（e）所示。
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q55

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本文編號(hào)：2621288