【摘要】：本研究通過高效表達(dá)載體pfq20將單細(xì)胞固氮藍(lán)藻Cyanothecesp.PCC 8801的nifHDK基因和綠螺旋桿菌(Heliobacterium chlorum)nifH)基因分別整合至單細(xì)胞非固氮藍(lán)藻Synechocystis sp.PCC 6803中,并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平的檢測,結(jié)果顯示兩種固氮微生物的nifHDK基因在Synechocystis sp.PCC 6803中均有轉(zhuǎn)錄,并且通過western blot檢測到綠螺旋桿菌的NifH蛋白表達(dá);同時,本研究將Synechocystis sp.PCC 6803中PmgR1基因的啟動子以及Cyoanothece sp.PCC 8801nifB和nifH前的啟動子序列與Cyanothece sp.PCC 8801nifH基因連接并整合至Synechocystis sp.PCC 6803基因組中,對轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)三種啟動子作用下的nifH在Synechocystis sp.PCC 6803中均有表達(dá),且表達(dá)量具有一定差異,在轉(zhuǎn)錄水平上,PmgR1基因啟動子作用下的nifH轉(zhuǎn)錄水平明顯受到光照條件的影響,在黑暗條件下轉(zhuǎn)錄水平持續(xù)增強,這些結(jié)果對在Synechocystis sp.PCC 6803中表達(dá)活性固氮酶蛋白具有一定參考意義。另一方面,本研究采用Doberener固體無氮培養(yǎng)基從具有發(fā)達(dá)根系的駱駝刺根際分離得到兩株具有固氮潛力的新菌T3和T22,并分別從生理生化、化學(xué)成分以及遺傳和進(jìn)化分析方面進(jìn)行鑒定,其中,T3屬于假單胞菌屬,將其命名為Pseudomonas urumqiensis sp.nov.,模式種為T3T(=ACCC 60124T=JCM 32830T),T22屬于Chitinophaga屬,將其命名為Chitinophaga alhagiae sp.nov.,模式種為T22T(=ACCC 60125T=KCTC 62518T)。
【圖文】：

８８０１？ｚ：／ＨＤｒ基因同源重組至載體Ｐｆｑ２０邋（中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所呂雪逡逑峰課題組惠贈），得到質(zhì)粒載體ｐｆｑ２０－ＨＣ？ｉ／？ＴＯ尺，ｐｆｑ２０－８８０１ｗ：／ＨＤ尺，具體載體構(gòu)建逡逑圖見圖２－Ｕ逡逑ｆ邋＼逡逑＾邋§邐Ｕ逡逑ｓｉｒ０１￥Ｓ邋■：邋｜邐ｒ＾ｃ邋－ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ邐ｎｉｆＨＤＫ逡逑：逡逑ｉ邋＼＼＼＼＼＼＼＼＼ｎ逡逑Ｖ＼邐／邋／邋ｓｆｒｏｍ逡逑？邋ｒ邋戶物逡逑Ｉ邋飛逡逑Ｈ邐／；ｙ邋ｓｌｒ０１６８逡逑＾邋Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ逡逑Ａｐ＇邐邐邐逡逑圖２－１載體構(gòu)建圖逡逑２．２．３．表達(dá)檢測逡逑將邋ｐｆｑ２０－８８０ｌ”丨／７／￡）尺，ｐｆｑ２０－ＨＣｗ：／？／Ｚ）Ａ：轉(zhuǎn)化至辦”ｅｃ／ｚｏｃ＾ｓｔａ邋ｓｐ．邋ＰＣＣ邋６８０３邋中，得逡逑到轉(zhuǎn)化藻株邋Ｓｙｎ－１２２６－１２邋和邋Ｓｙｎ－１２２６－６。逡逑１７逡逑

將轉(zhuǎn)化藻株在連續(xù)光照的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，分別從ＤＮＡ整合水平上進(jìn)行檢測。采逡逑用不同的引物組合對轉(zhuǎn)化藻株Ｓｙｎ－１２２６－１２和Ｓｙｎ－１２２６－６中外源的整合情況逡逑進(jìn)行檢測，得到符合目的條帶大小的條帶（圖２－２），說明目的基因整合至辦逡逑ｓｐ．邋ＰＣＣ邋６８０３基因組中，０１６８－Ｆ／Ｒ擴(kuò)增沒有５００ｂｐ條帶，說明外源基因整合完全。逡逑圖２－２分別用不同引物組合對轉(zhuǎn)化藻株Ｓｙｎ－１２２６－１２和Ｓｙｎ－１２２６－６的基因組逡逑ＤＮＡ邋進(jìn)行邋ＰＣＲ邋得到的產(chǎn)物：１，Ｐｒｂｃ－Ｆ／８８０１－Ｋ２－０９２６，邋２，邋８８０１－Ｈ１－０９２６／０１６８－Ｒ，３，逡逑０１６８－Ｆ／０１６８－Ｒ，邋４，邋Ｐｒｂｃ－Ｆ／ＨＣ－Ｋ２－０９２６，邋５，邋ＨＣ－Ｈ１－０９２６／０１６８－Ｒ，邋６，，邋０１６８－Ｆ／０１６８－Ｒ，逡逑Ｍ，從上至下依次為邋８０００ｂｐ、５０００邋ｂｐ、３０００邋ｂｐ、２０００邋ｂｐ、１０００邋ｂｐ、７５０邋ｂｐ、５００邋ｂｐ、逡逑２５０邋ｂｐ、１００邋（下文圖中所用Ｍ相同）逡逑２．２．３．２蛋白水平Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ檢測逡逑分別收集轉(zhuǎn)化藻株Ｓｙｎ－１２２６－１２和Ｓｙｎ－１２２６－６的上清和沉淀蛋白，處理后進(jìn)行逡逑ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測，一抗為本研究制備的ＮｉｆＨ多克隆抗體，二抗兔抗鼠抗體（康為世逡逑紀(jì)）
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士后
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q936;Q78

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7 徐婉Z

本文編號：2620464