【摘要】：藍(lán)藻Synechococcus elongatus PCC 7942(S.elongatus PCC 7942)是目前研究生物鐘節(jié)律性最簡(jiǎn)單的模式生物,其核心鐘蛋白KaiA/B/C可以依賴于翻譯后振蕩機(jī)制(Post Translational Oscillation,PTO)進(jìn)行節(jié)律性振蕩,并且這種節(jié)律性振蕩方式能夠在添加適量ATP的情況下,在離體實(shí)驗(yàn)中重建。在生物鐘節(jié)律性的調(diào)控中,與核心振蕩系統(tǒng)運(yùn)作過(guò)程最相關(guān)的是生物鐘信號(hào)輸入和信號(hào)輸出途徑的鐘基因的表達(dá)調(diào)控,它們以依賴于轉(zhuǎn)錄翻譯反饋環(huán)(Transcription Translation Feedback Loop,TTFL)的方式對(duì)生物鐘的節(jié)律性行使調(diào)控作用。借助于信號(hào)輸入途徑,藍(lán)藻生物鐘系統(tǒng)可以感知環(huán)境時(shí)刻信號(hào)并將其傳遞給生物鐘核心振蕩器,而后信號(hào)輸出途徑可以將核心鐘生成的內(nèi)源時(shí)間信號(hào)傳遞給受生物鐘調(diào)控的下游基因,這些輸入/輸出途徑鐘基因的節(jié)律性表達(dá)對(duì)藍(lán)藻光合作用等基礎(chǔ)代謝活動(dòng)的有效進(jìn)行至關(guān)重要。環(huán)境中的光信號(hào)和細(xì)胞內(nèi)的氧化還原信號(hào)均可以重置生物鐘的晝夜節(jié)律相位,在藍(lán)藻細(xì)胞中參與細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)維持的主要有過(guò)氧化還原蛋白(Peroxiredoxins,Prx)、硫氧還蛋白(Thioredoxin,Trx)和谷氧還蛋白(Glutathione、Grx)等。前人的研究結(jié)果表明,藍(lán)藻中典型的2-Cys Prx(Prx-SO_(2/3)節(jié)律性標(biāo)簽)在氧化還原狀態(tài)水平上存在晝夜節(jié)律振蕩。Prx-SO_(2/3)節(jié)律性標(biāo)簽的氧化還原狀態(tài)節(jié)律性振蕩方式不同于前述PTO和TTFL機(jī)制,而是以一種非轉(zhuǎn)錄依賴的振蕩(Non-transcriptional Oscillator,NTO)機(jī)制維持運(yùn)轉(zhuǎn)。硫氧還蛋白還原酶(Thioredoxin reductase,TR)在Prx蛋白氧化還原再循環(huán)過(guò)程中起關(guān)鍵的調(diào)控作用,而谷胱甘肽合成酶(Glutathione synthase,GS)參與Prxs家族中1-Cys Prx輔助因子的合成。Prx廣泛存在于古細(xì)菌,細(xì)菌和真核生物中,在進(jìn)化上保持了高度的保守性,以其為基礎(chǔ)的Prx-SO_(2/3)節(jié)律性標(biāo)簽也廣泛存在于上述不同的生命體中。由于基于TTFL和PTO的生物體的內(nèi)源生物鐘時(shí)間保持機(jī)制在不同進(jìn)化階元的生命體中并不保守,因此深入探究跨物種通用的Prx-SO_(2/3)節(jié)律性標(biāo)簽的NTO分子調(diào)控機(jī)制,并探索NTO時(shí)間保持機(jī)制與具有多樣性的TTFL和PTO時(shí)間保持機(jī)制之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系在生物鐘基礎(chǔ)理論研究方面具有較為重要的理論價(jià)值。本論文以模式藍(lán)藻S.elongatus PCC 7942為研究對(duì)象,對(duì)承擔(dān)藍(lán)藻Kai生物鐘主要輸入和輸出途徑的關(guān)鍵基因群與Prx-SO_(2/3)節(jié)律性標(biāo)簽運(yùn)轉(zhuǎn)維持的已知調(diào)控者prx基因家族成員、TR和GS等基因在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上的節(jié)律性特征進(jìn)行了較為細(xì)致地研究,并對(duì)這二組基因及其表達(dá)產(chǎn)物之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系進(jìn)行了探究。相關(guān)研究結(jié)果初步確定基于藍(lán)藻TTFL和PTO機(jī)制的Kai生物鐘和以NTO機(jī)制為基礎(chǔ)的Prx-SO_(2/3)節(jié)律性標(biāo)簽之間不是相互獨(dú)立的,所以二者可以通過(guò)CikA等環(huán)境時(shí)刻信息輸入途徑關(guān)鍵基因表達(dá)產(chǎn)物及2-Cys Prx蛋白的相互作用共同影響藍(lán)藻生物鐘的節(jié)律性表型。在此過(guò)程中,CikA與2-Cys Prx之間到底是發(fā)生了直接的蛋白質(zhì)互作,還是二者間只是間接的功能性互作還有待下一步工作的深入研究。論文的主要研究?jī)?nèi)容如下:1、在非生物脅迫下篩選得到了S.elongatus PCC 7942 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)的最適內(nèi)參基因,為后續(xù)研究生物鐘輸出途徑基因和prx家族基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)模式奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。研究結(jié)果表明:prs和secA組合是適用于所有脅迫條件和高光脅迫下最適的內(nèi)參基因。而secA和ppc,rimM和rnpA,rnpA和ilvD組合則分別在NTC,NaCl和H_2O_2脅迫條件下表達(dá)最為穩(wěn)定。rimM只在特定條件下穩(wěn)定表達(dá),應(yīng)慎重選擇。16S和rnpB不適合在S.elongatus PCC7942中作為內(nèi)參基因。2、構(gòu)建了Kai生物鐘輸出途徑相關(guān)基因和Prx-SO_(2/3)節(jié)律性標(biāo)簽編碼基因2-cys prx的單基因敲除突變體,并在不同突變體中使用RT-qPCR技術(shù)探究了相關(guān)基因的表達(dá)模式。結(jié)果表明:敲除cikA和sasA基因,直接導(dǎo)致rpaA基因的表達(dá)失去了節(jié)律性。敲除2-cys prx基因主要改變了cikA、rpaA和1-cys prx等基因的振幅,或者推遲了其表達(dá)節(jié)律性相位。研究中還發(fā)現(xiàn)了尚未報(bào)道的prx家族成員1-cys prx,prxQ-A1和prxQ-B等基因的轉(zhuǎn)錄節(jié)律性,而敲除2-cys prx基因則會(huì)造成它們節(jié)律性表達(dá)模式的喪失。2-cys prx在轉(zhuǎn)錄水平上并未發(fā)現(xiàn)節(jié)律性,但敲除2-cys prx會(huì)提高cikA基因的振幅,可能表明2-cys prx在cikA上游行使生物鐘節(jié)律性調(diào)控功能。3、構(gòu)建了2-cys prx和cikA、TR和GS的單敲藍(lán)藻株系和雙敲除藍(lán)藻株系,進(jìn)而探究了它們?cè)诓煌鈴?qiáng)下周期長(zhǎng)度的變化。結(jié)果表明:高光脅迫和低光脅迫均能顯著縮短目標(biāo)藍(lán)藻的晝夜節(jié)律周期長(zhǎng)度。2-cys prx基因的敲除(突變體簡(jiǎn)稱為d2Cys)不影響藻核心鐘的周期長(zhǎng)度。TR基因敲除藍(lán)藻(TR敲除株系,簡(jiǎn)稱為dTR)僅在正常光強(qiáng)下周期長(zhǎng)度顯著縮短,GS基因敲除藍(lán)藻(GS敲除株系,簡(jiǎn)稱為dGS)對(duì)藍(lán)藻生物鐘的影響較小。TR和GS與2-cys prx基因分別組合的雙敲除藍(lán)藻株系(分別簡(jiǎn)稱為d2Cys/dTR和d2Cys/dGS)表現(xiàn)出極顯著的核心鐘周期縮短的表型,表明TR和GS與2-cys prx基因分別參與了3條相互獨(dú)立,但是可以發(fā)生功能代償?shù)牟煌盘?hào)途徑,并參與了生物鐘的環(huán)境時(shí)刻信號(hào)的輸入途徑。在同一光強(qiáng)下,cikA單敲除藍(lán)藻株系(CikA敲除株系,簡(jiǎn)稱為dCikA)具有晝夜節(jié)律,但周期長(zhǎng)度顯著縮短,cikA與2-cys prx基因雙敲除的藍(lán)藻株系(簡(jiǎn)稱為d2Cys/dCikA)表現(xiàn)出核心鐘完全喪失節(jié)律性的無(wú)節(jié)律表型,這暗示了cikA與2-cys prx基因可能共同參與調(diào)控藍(lán)藻生物鐘核心振蕩器的環(huán)境時(shí)刻信號(hào)輸入過(guò)程且具有功能互作。4、藍(lán)藻2-Cys Prx與CikA蛋白互作的檢測(cè)。利用雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(BiFC)檢測(cè)的結(jié)果表明:二者在類似藍(lán)藻細(xì)胞生理環(huán)境的煙草葉綠體中能夠激發(fā)互作熒光信號(hào)。而在不進(jìn)行光合作用的酵母細(xì)胞中實(shí)施的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)則檢測(cè)不到2-Cys Prx與CikA蛋白的相互作用。這種來(lái)自BiFC和酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果看似矛盾,但初步表明依賴于正常光合電子傳遞過(guò)程的細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)很可能是2-Cys Prx與CikA蛋白互作的前提條件。當(dāng)然,這一推論目前還需要更進(jìn)一步的確鑿實(shí)驗(yàn)證據(jù)來(lái)檢驗(yàn)與證明。
【圖文】：

Table 2-6 RT-PCR verification of internal reference genes組分 使用量Premix Taq 10 μlUpstream primer（20 mM） 0.2 μlDownstream primer（20 mM） 0.2 μlcDNA 1.0 μlddH2O 8.6 μlTotal 20 μl.2.6 候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析實(shí)驗(yàn)中 9 個(gè)候選內(nèi)參基因獲取的 RT-qPCR 擴(kuò)增數(shù)據(jù)由 CFX96 實(shí)時(shí) PCR 檢測(cè)系 CFX Manager 軟件采集，采用 Excel 進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析工作。所選基因分別三種內(nèi)參基因統(tǒng)計(jì)分析軟件 geNorm (version 3.5)[132]，，NormFinder (version 0.953)和 BestKeeper (version 1.0)[134]]來(lái)分析九個(gè)管家基因在不同脅迫處理和不同組織中達(dá)穩(wěn)定性。geNorm 軟件以 RT-qPCR 檢測(cè)的 Ct 值為數(shù)據(jù)分析的依據(jù)，然后通過(guò)

西北大學(xué)碩士學(xué)位論文表 2-7 內(nèi)參基因的 RT-qPCR 檢測(cè)體系Table 2-7 RT-qPCR verification of internal reference genes組分 使用量SYBR Premix Ex Taq 5 μlUpstream primer（20 mM） 0.2 μlDownstream primer（20 mM） 0.2 μlcDNA 1.0 μlddH2O 3.6 μlTotal 10 μl
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q418

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本文編號(hào)：2620216