【摘要】：近年來,超分辨熒光顯微鏡不僅可以對原位細(xì)胞膜上的蛋白進(jìn)行特異性標(biāo)記,而且還可以達(dá)到單分子精度,實現(xiàn)納米級的成像,這對于研究細(xì)胞膜上的蛋白分布特點具有重要作用。然而,細(xì)胞膜上的蛋白分布緊密,這對蛋白標(biāo)記又提出了新的挑戰(zhàn),最近提出的延展顯微鏡將生物樣品機(jī)械性放大進(jìn)而突破了光學(xué)衍射,這就使得原本排列緊密的生物分子距離增加。本論文將延展顯微鏡(Expansion microscopy,ExM)與隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微鏡(Stochastic optical reconstruction microscopy,STORM)兩種技術(shù)相結(jié)合,通過對擴(kuò)展后的細(xì)胞膜上蛋白進(jìn)行STORM成像,研究細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)的分布特點。采用延展顯微鏡操作方法將A549-GFP細(xì)胞黏附于凝膠上,利用轉(zhuǎn)盤激光掃描共聚焦顯微鏡對凝膠擴(kuò)展前后的細(xì)胞進(jìn)行成像對比。結(jié)果顯示,A549-GFP細(xì)胞隨著凝膠的擴(kuò)展,細(xì)胞也隨之增大。細(xì)胞的增大倍數(shù)與擴(kuò)展溶液中離子含量以及擴(kuò)展時間都有關(guān)系,在去離子水中,細(xì)胞可獲得最大倍數(shù)的擴(kuò)展,各方向可達(dá)2.51±0.47倍。為了對細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)進(jìn)行觀察分析其分布特點,本論文分析對比了多種不同思路來制備擴(kuò)展后的細(xì)胞膜,最終發(fā)現(xiàn)將細(xì)胞膜與凝膠共價靶向相連后,可以在擴(kuò)展后的凝膠上撕取擴(kuò)展后的細(xì)胞膜。利用上述制備的擴(kuò)展后細(xì)胞膜經(jīng)抗體特異性標(biāo)記后,使用dSTORM進(jìn)行成像發(fā)現(xiàn),擴(kuò)展后的細(xì)胞膜上Band III蛋白定位點密度從475.4±27.73μm~(-2)減小到386.9±40.86μm~(-2),簇密度從1.373±0.0898μm~(-2)減少到1.126±0.1066μm~(-2),擴(kuò)展前較大的蛋白簇變小,細(xì)胞上蛋白簇的平均面積從11866±649.8 nm~2減少到5749±546.4 nm~2,簇內(nèi)定位點數(shù)也減少,簇內(nèi)平均點數(shù)140.1±9.927變?yōu)?16.1±6.737。單個蛋白間距離也增加從47.61±2.62 nm變?yōu)?7.81±5.21 nm。利用dSTORM對RNA aptamer標(biāo)記的細(xì)胞膜外側(cè)EpCAM蛋白進(jìn)行成像也發(fā)現(xiàn)相同的結(jié)果,隨著凝膠的擴(kuò)展,細(xì)胞膜上蛋白簇的直徑變小,簇內(nèi)點數(shù)變少。而單個蛋白間距離增加,擴(kuò)展前39.53±3.53 nm增加到擴(kuò)展后92.11±6.75 nm,擴(kuò)大了2.3倍。比抗體而言,RNA aptamer體積小,標(biāo)記效率更高,熒光探針擴(kuò)展后距離也增加更大,更有利于成像。這一研究成果證實延展顯微鏡和單分子定位顯微鏡兩種超分辨顯微鏡的聯(lián)合使用,對于研究細(xì)胞膜上蛋白的分布特點,闡明蛋白簇的形態(tài)結(jié)構(gòu)具有重要意義。
【圖文】：

圖 1-1 延展顯微鏡的原理[13]Fig.1-1 Concept of expansion microscopy (ExM)[13]記的三功能團(tuán)標(biāo)記物結(jié)構(gòu)示意圖；b）ExM 標(biāo)記圖解，其中綠色代表細(xì)胞微凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；c) 三功能團(tuán)標(biāo)記物連接凝膠和生物樣品的分子圖解，紫色，灰色代表抗體，藍(lán)色代表寡核苷酸片段，橙色圓點代表三功能團(tuán)標(biāo)記物烯�；�，綠色圓圈代表熒光分子；d) ExM 凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖，黑色圓點表示子水?dāng)U展后的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖。atic of label that can be anchored to the gel at site of a biomolecule; b) Schematicules (green) and polymer network (orange); c) The label of b), hybridized to thearing secondary antibody top (top gray shape) bound via the primary (bottom grayules (purple), is incorporated into the gel (orange lines) via the methacryloyl grouchematic of collapsed polyelectrolyte network, showing cross linker (dot) and poe); e) Expanded network after H2O dialysis.展后的生物樣品通過熒光顯微鏡進(jìn)行成像，目前使用較多的是寬掃描轉(zhuǎn)盤激光掃描共聚焦顯微鏡，凝膠經(jīng)過 4.5 倍的線性擴(kuò)展，E到 60~70 nm[25]。

圖 1-2 iExM 原理圖解[28]Fig.1-2 iterative ExM (iExM) concept[28]M 原理圖解，a）生物樣品；b）第一次凝膠；c）擴(kuò)展；d）第二次凝膠再次擴(kuò)展；f) - j）iExM 原理分子圖解，，f）一抗（灰色）、偶聯(lián)寡核苷（灰色）以及含有寡核苷酸鏈 A（綠色，與 A'互補(bǔ)）和甲基丙烯�；� I 標(biāo)記生物分子（灰色圓圈）；g）第一次凝膠示意圖（1 和 2 代表兩個在雙重去離子水中擴(kuò)展后，帶有熒光團(tuán)（黃色）、寡核苷酸鏈 A'（紫色黑色圓點）的三功能團(tuán)標(biāo)簽 II 與功能團(tuán)標(biāo)簽 I 雜交示意圖；i）第二次凝次合成的凝膠，再次進(jìn)行擴(kuò)展后生物分子（1 和 2）遠(yuǎn)離的示意圖。ematic of iterative expansion.a) specimen; b) the first polyelectrolyte ged expansion.d) a second polyelectrolyte gel network, e) it is expanded after  j) Molecular view of the iExM process. f)Biomolecules of interest (gra with a primary antibody followed by a secondary antibody conjugated to a') molecule, then a complementary DNA (green,sequence A) bearing a ydite, black dot). g) The sample (two example biomolecules are labeled "n a cleavable swellable polyelectrolyte gel (blue mesh). This gel incorporate at the gel-anchoring site, and it is expanded. h) A DNA oligo with thpurple strand) bearing a fluorophore (yellow star) and a new gelanchlack dot) is hybridized to the anchored A sequence DNA (green). i) A sec
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q241

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本文編號：2617855