【摘要】：由于植物細胞在進行光合作用的過程中.同時發(fā)生著光呼吸,導(dǎo)致凈光合速率會下降25%-50%。乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase,GOX)作為光呼吸途徑的關(guān)鍵酶之一,定位于過氧化物酶體中,以黃素單核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)為輔因子催化乙醇酸氧化為乙醛酸。在人體內(nèi),GOX可以催化乙醇酸和乙醛酸生成草酸,而草酸是腎結(jié)石的主要成分,因此近年來GOX被作為一個治療腎結(jié)石和原發(fā)性高草酸尿綜合征的有效靶點。目前,人們已在酶學(xué)等方面對GOX有了一定了解,并解析了一些含F(xiàn)MN的GOX晶體結(jié)構(gòu),但是,尚無不含輔因子FMN的GOX結(jié)構(gòu)的報道,人們對于GOX如何行使其催化功能的分子機制、FMN如何結(jié)合到活性中心的過程等并不清楚。為了解決上述問題,本論文結(jié)合結(jié)構(gòu)生物學(xué)以及生物化學(xué)與分子生物學(xué)等方法對此進行了深入研究。本論文通過原核表達并在純化過程中嘗試多種緩沖液后,獲得了含有輔因子FMN的本生煙GOX蛋白(Holo-GOX)和不含輔因子FMN的本生煙GOX蛋白(Apo-GOX),采用蒸汽擴散法成功獲得并優(yōu)化了 Holo-GOX和Apo-GOX的蛋白晶體,進而解析了它們的晶體結(jié)構(gòu)。通過中性緩沖液純化的GOX含有FMN,具有很強的酶活力;而通過弱堿性緩沖液純化的GOX不含F(xiàn)MN,基本喪失了酶活力。本論文首次獲得了 Apo-GOX的晶體結(jié)構(gòu),通過分析比較Holo-GOX和Apo-GOX的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),它們都是由8個排列在內(nèi)側(cè)的β折疊片層和8股環(huán)繞在外側(cè)的α螺旋組成的(β/α)8桶型結(jié)構(gòu)。在Holo-GOX中.FMN位于桶型結(jié)構(gòu)β折疊組的羧基端,通過氫鍵與GOX相結(jié)合,loop6、loop4和αB-αC之間的loop形成“蓋子”蓋在桶型結(jié)構(gòu)β折疊組羧基端的開口處,阻止FMN解離。在Apo-GOX中,loop6和αB-αC之間的loop向外側(cè)溶液方向擺動,將開口打開,同時loop4上的αD消失,整體柔性也變得更大,“蓋子”變?yōu)殚_啟狀態(tài),FMN從GOX上解離,活性中心口袋的電荷也隨著結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。Holo-GOX和Apo-GOX在晶體結(jié)構(gòu)和溶液中都以四聚體形式存在,但Apo-GOX的聚集狀態(tài)更為松散。在對Apo-GOX各亞基互作界面的分子間作用力進行分析后發(fā)現(xiàn),一些在Holo-GOX亞基之間形成的鹽鍵和氫鍵網(wǎng)絡(luò),特別是組成“蓋子”的3個loop中的氨基酸殘基部分,在Apo-GOX中隨著結(jié)構(gòu)的變化而消失。本論文首次發(fā)現(xiàn)一個存在于分子間界面的pH傳感器(sensor),當(dāng)緩沖液從中性變?yōu)槿鯄A性時,pH傳感器內(nèi)的分子間作用力減弱甚至被破壞,導(dǎo)致蓋子結(jié)構(gòu)由“關(guān)閉”變?yōu)椤按蜷_”狀態(tài),從而釋放FMN。在這個過程中,四聚體中的每個亞基輕微旋轉(zhuǎn),桶型結(jié)構(gòu)β折疊組羧基端開口處的互作面積減少,同時GOX羧基末端“尾巴”處的αG與相鄰GOX的α6形成新的結(jié)合表面。在與同源性較差的人GOX的結(jié)構(gòu)進行比對后發(fā)現(xiàn),該分子間pH傳感器同樣存在。本論文通過解析Holo-GOX和Apo-GOX的晶體結(jié)構(gòu),為深入研究GOX的催化作用機制提供了結(jié)構(gòu)依據(jù),為通過調(diào)節(jié)pH來改變GOX的酶活性從而控制光呼吸途徑提供了新思路,為以GOX為靶點的腎結(jié)石和原發(fā)性高草酸尿綜合征的治療提供了新的方向。
【圖文】：

為了探宄ＧＯＸ的ＰＴＳ是否存在于其羧基端，Ｖｏｌｏｋｉｔａ等構(gòu)建了羧基端截短的Ｐ－葡逡逑萄糖醛縮酶（ＧＵＳ）和本生煙ＧＯＸ的羧基端六肽組成的融合蛋白，并通過轉(zhuǎn)基因植物逡逑研宄ＧＯＸ的轉(zhuǎn)運，結(jié)果發(fā)現(xiàn)約５０％的融合蛋白被定位到了過氧化物酶體中（圖１－２），逡逑因此推測ＧＯＸ羧基端的六肽中含有ＰＴＳ序列（Ｖｏｌｏｋｉｔ＾邋１９９１）。逡逑但是，也有證據(jù)表明ＧＯＸ的ＰＴＳ并不只存在于其羧基端。１９９５年Ｈｏｍｇ等利用體逡逑外運送系統(tǒng)來研究ＧＯＸ向乙醛酸循環(huán)體轉(zhuǎn)運的情況時發(fā)現(xiàn)，，該轉(zhuǎn)運是一個依賴于溫逡逑度并需要ＡＴＰ的過程，他們設(shè)計了邋３個突變蛋白并觀察其轉(zhuǎn)運情況，發(fā)現(xiàn)缺失氨基端逡逑５９個氨基酸殘基和羧基端５３個氨基酸殘基的截短片段蛋白均能進行轉(zhuǎn)運，而用羧基逡逑端２０個氨基酸殘基與二氫葉酸還原酶連接的融合蛋白卻不能進行正常的轉(zhuǎn)運。因此他逡逑們認為：不管羧基端的氨基酸序列所起的作用如何，可能還存在其它的ＰＴＳ序列逡逑（Ｈｏｍｇ邋ｅｔ邋ａｌ．５１９９５；邋Ｌｏｐｅｚ－Ｈｕｅｒｔａｓ邋ｅｔ邋ａｌ．５１９９９）0逡逑４逡逑

轉(zhuǎn)化為絲氨酸，同時釋放Ｃ0２，這是光呼吸的產(chǎn)物；之后絲氨酸又可轉(zhuǎn)回過氧化物酶逡逑體中轉(zhuǎn)變?yōu)榱u基丙酮酸，經(jīng)氧化生成甘油酸；甘油酸從過氧化物酶體返回葉綠體后會逡逑轉(zhuǎn)化為磷酸甘油酸（圖１－３）。逡逑ＣＡＬＶＩＮ邐Ｒｉｂｕｔｏｓｅ邋１．５邋？逡逑ＣＹＣＬＥ邐ｂｉ５ｐｈｏｓｐｌＴＱｔ９＾＞ｕ２逡逑？＊Ｈｙ１邐—＇——＊邋Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ邐人逡逑ｒ－，＿邐ｇｔ＾ｅｒａｔｅ０＇阡0々＿仙逡逑Ｈ－Ｊ邋Ｐａｌａｔｅ邐ＡＯＰ－￣Ｌ邋ｐ逡逑ＡＴＰ—ｒ－＾１邐ｉ逡逑Ｇｌｙｃｅｒａｔｅ邐Ｇｌｙｃｏｌａｔｅ逡逑－ｇ—ＯｘａｌＤＱｃｅｉａｔｅ邐＾＾邐ＣＨＬＯＲＯＰＬＡＳＴ邋，逡逑ｒ邐邐邐一N逡逑Ｉ邐．．邐．邐．邐Ｇｌｙｃｅｒａｔｅ邐２ＧＪｙｃｏｔａｔｅ邐ｉ逡逑■邐ＮＡＤ＜－￣－邋邐邋邐＾－0２邐邐逡逑｜［ｍｄｈ１邐W〔邋W邋ｐ逡逑ＯｘＳ＾ＮＡＤＨ－＾邐＾Ｈ２0２邋—？邋Ｈ２０逡逑Ｉ邋ａｃｅｔａｔｅ邐備邐＋１／２0２邐腿逡逑Ｉ邐Ｈｙｄｒｏｘｙｐｙａｉｖａｔｅ邋２Ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ邐｜逡逑ｓ邐＼＼邋＾Ｇｌｕｔａｍａｔｅ邋＾：—逡逑Ｉ邐［Ｓ＾］邋Ｘ＂邋＞邋［Ｇ＾ｆ］邐＇逡逑｜邐／邐＾、＞２－0ｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ逡逑＾ＰＥＲＯＸＩＳＯＭＥ邋Ｓｅ｜ｉｎｅ邐２ＧｌＪｃｉｎｅ邐Ｊ逡逑（邐０邐Ｃ0２邐０邐＾逡逑Ｉ邐ＮＨ３邋Ｉ逡逑Ｓｅｒｉｎｅ邋＊—２Ｇｌｙｃｉｎｅ逡逑—（＿１邐？邋Ｏｘａｉｏａｃｅｔａｔｅ＾．邐＊邐、逡逑丫邐邐ＮＡＯＨ邋ＮＡＤ逡逑＾ｙ￣ＭａｌＱ
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q55

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號：2616915