【摘要】：由于植物細(xì)胞在進(jìn)行光合作用的過程中.同時發(fā)生著光呼吸,導(dǎo)致凈光合速率會下降25%-50%。乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase,GOX)作為光呼吸途徑的關(guān)鍵酶之一,定位于過氧化物酶體中,以黃素單核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)為輔因子催化乙醇酸氧化為乙醛酸。在人體內(nèi),GOX可以催化乙醇酸和乙醛酸生成草酸,而草酸是腎結(jié)石的主要成分,因此近年來GOX被作為一個治療腎結(jié)石和原發(fā)性高草酸尿綜合征的有效靶點。目前,人們已在酶學(xué)等方面對GOX有了一定了解,并解析了一些含F(xiàn)MN的GOX晶體結(jié)構(gòu),但是,尚無不含輔因子FMN的GOX結(jié)構(gòu)的報道,人們對于GOX如何行使其催化功能的分子機制、FMN如何結(jié)合到活性中心的過程等并不清楚。為了解決上述問題,本論文結(jié)合結(jié)構(gòu)生物學(xué)以及生物化學(xué)與分子生物學(xué)等方法對此進(jìn)行了深入研究。本論文通過原核表達(dá)并在純化過程中嘗試多種緩沖液后,獲得了含有輔因子FMN的本生煙GOX蛋白(Holo-GOX)和不含輔因子FMN的本生煙GOX蛋白(Apo-GOX),采用蒸汽擴散法成功獲得并優(yōu)化了 Holo-GOX和Apo-GOX的蛋白晶體,進(jìn)而解析了它們的晶體結(jié)構(gòu)。通過中性緩沖液純化的GOX含有FMN,具有很強的酶活力;而通過弱堿性緩沖液純化的GOX不含F(xiàn)MN,基本喪失了酶活力。本論文首次獲得了 Apo-GOX的晶體結(jié)構(gòu),通過分析比較Holo-GOX和Apo-GOX的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),它們都是由8個排列在內(nèi)側(cè)的β折疊片層和8股環(huán)繞在外側(cè)的α螺旋組成的(β/α)8桶型結(jié)構(gòu)。在Holo-GOX中.FMN位于桶型結(jié)構(gòu)β折疊組的羧基端,通過氫鍵與GOX相結(jié)合,loop6、loop4和αB-αC之間的loop形成“蓋子”蓋在桶型結(jié)構(gòu)β折疊組羧基端的開口處,阻止FMN解離。在Apo-GOX中,loop6和αB-αC之間的loop向外側(cè)溶液方向擺動,將開口打開,同時loop4上的αD消失,整體柔性也變得更大,“蓋子”變?yōu)殚_啟狀態(tài),FMN從GOX上解離,活性中心口袋的電荷也隨著結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。Holo-GOX和Apo-GOX在晶體結(jié)構(gòu)和溶液中都以四聚體形式存在,但Apo-GOX的聚集狀態(tài)更為松散。在對Apo-GOX各亞基互作界面的分子間作用力進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn),一些在Holo-GOX亞基之間形成的鹽鍵和氫鍵網(wǎng)絡(luò),特別是組成“蓋子”的3個loop中的氨基酸殘基部分,在Apo-GOX中隨著結(jié)構(gòu)的變化而消失。本論文首次發(fā)現(xiàn)一個存在于分子間界面的pH傳感器(sensor),當(dāng)緩沖液從中性變?yōu)槿鯄A性時,pH傳感器內(nèi)的分子間作用力減弱甚至被破壞,導(dǎo)致蓋子結(jié)構(gòu)由“關(guān)閉”變?yōu)椤按蜷_”狀態(tài),從而釋放FMN。在這個過程中,四聚體中的每個亞基輕微旋轉(zhuǎn),桶型結(jié)構(gòu)β折疊組羧基端開口處的互作面積減少,同時GOX羧基末端“尾巴”處的αG與相鄰GOX的α6形成新的結(jié)合表面。在與同源性較差的人GOX的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn),該分子間pH傳感器同樣存在。本論文通過解析Holo-GOX和Apo-GOX的晶體結(jié)構(gòu),為深入研究GOX的催化作用機制提供了結(jié)構(gòu)依據(jù),為通過調(diào)節(jié)pH來改變GOX的酶活性從而控制光呼吸途徑提供了新思路,為以GOX為靶點的腎結(jié)石和原發(fā)性高草酸尿綜合征的治療提供了新的方向。
【圖文】：

為了探宄ＧＯＸ的ＰＴＳ是否存在于其羧基端，Ｖｏｌｏｋｉｔａ等構(gòu)建了羧基端截短的Ｐ－葡逡逑萄糖醛縮酶（ＧＵＳ）和本生煙ＧＯＸ的羧基端六肽組成的融合蛋白，并通過轉(zhuǎn)基因植物逡逑研宄ＧＯＸ的轉(zhuǎn)運，結(jié)果發(fā)現(xiàn)約５０％的融合蛋白被定位到了過氧化物酶體中（圖１－２），逡逑因此推測ＧＯＸ羧基端的六肽中含有ＰＴＳ序列（Ｖｏｌｏｋｉｔ＾邋１９９１）。逡逑但是，也有證據(jù)表明ＧＯＸ的ＰＴＳ并不只存在于其羧基端。１９９５年Ｈｏｍｇ等利用體逡逑外運送系統(tǒng)來研究ＧＯＸ向乙醛酸循環(huán)體轉(zhuǎn)運的情況時發(fā)現(xiàn)，，該轉(zhuǎn)運是一個依賴于溫逡逑度并需要ＡＴＰ的過程，他們設(shè)計了邋３個突變蛋白并觀察其轉(zhuǎn)運情況，發(fā)現(xiàn)缺失氨基端逡逑５９個氨基酸殘基和羧基端５３個氨基酸殘基的截短片段蛋白均能進(jìn)行轉(zhuǎn)運，而用羧基逡逑端２０個氨基酸殘基與二氫葉酸還原酶連接的融合蛋白卻不能進(jìn)行正常的轉(zhuǎn)運。因此他逡逑們認(rèn)為：不管羧基端的氨基酸序列所起的作用如何，可能還存在其它的ＰＴＳ序列逡逑（Ｈｏｍｇ邋ｅｔ邋ａｌ．５１９９５；邋Ｌｏｐｅｚ－Ｈｕｅｒｔａｓ邋ｅｔ邋ａｌ．５１９９９）0逡逑４逡逑

轉(zhuǎn)化為絲氨酸，同時釋放Ｃ0２，這是光呼吸的產(chǎn)物；之后絲氨酸又可轉(zhuǎn)回過氧化物酶逡逑體中轉(zhuǎn)變?yōu)榱u基丙酮酸，經(jīng)氧化生成甘油酸；甘油酸從過氧化物酶體返回葉綠體后會逡逑轉(zhuǎn)化為磷酸甘油酸（圖１－３）。逡逑ＣＡＬＶＩＮ邐Ｒｉｂｕｔｏｓｅ邋１．５邋？逡逑ＣＹＣＬＥ邐ｂｉ５ｐｈｏｓｐｌＴＱｔ９＾＞ｕ２逡逑？＊Ｈｙ１邐—＇——＊邋Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ邐人逡逑ｒ－，＿邐ｇｔ＾ｅｒａｔｅ０＇阡0々＿仙逡逑Ｈ－Ｊ邋Ｐａｌａｔｅ邐ＡＯＰ－￣Ｌ邋ｐ逡逑ＡＴＰ—ｒ－＾１邐ｉ逡逑Ｇｌｙｃｅｒａｔｅ邐Ｇｌｙｃｏｌａｔｅ逡逑－ｇ—ＯｘａｌＤＱｃｅｉａｔｅ邐＾＾邐ＣＨＬＯＲＯＰＬＡＳＴ邋，逡逑ｒ邐邐邐一N逡逑Ｉ邐．．邐．邐．邐Ｇｌｙｃｅｒａｔｅ邐２ＧＪｙｃｏｔａｔｅ邐ｉ逡逑■邐ＮＡＤ＜－￣－邋邐邋邐＾－0２邐邐逡逑｜［ｍｄｈ１邐W〔邋W邋ｐ逡逑ＯｘＳ＾ＮＡＤＨ－＾邐＾Ｈ２0２邋—？邋Ｈ２０逡逑Ｉ邋ａｃｅｔａｔｅ邐備邐＋１／２0２邐腿逡逑Ｉ邐Ｈｙｄｒｏｘｙｐｙａｉｖａｔｅ邋２Ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ邐｜逡逑ｓ邐＼＼邋＾Ｇｌｕｔａｍａｔｅ邋＾：—逡逑Ｉ邐［Ｓ＾］邋Ｘ＂邋＞邋［Ｇ＾ｆ］邐＇逡逑｜邐／邐＾、＞２－0ｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ逡逑＾ＰＥＲＯＸＩＳＯＭＥ邋Ｓｅ｜ｉｎｅ邐２ＧｌＪｃｉｎｅ邐Ｊ逡逑（邐０邐Ｃ0２邐０邐＾逡逑Ｉ邐ＮＨ３邋Ｉ逡逑Ｓｅｒｉｎｅ邋＊—２Ｇｌｙｃｉｎｅ逡逑—（＿１邐？邋Ｏｘａｉｏａｃｅｔａｔｅ＾．邐＊邐、逡逑丫邐邐ＮＡＯＨ邋ＮＡＤ逡逑＾ｙ￣ＭａｌＱ
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q55

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2616915